熊去氧膽酸聯合異甘草酸鎂干預四氯化碳誘導小鼠急性肝損傷研究

王淑萍，黃全祥，張宏岐

(湖北省宜昌市第三人民醫院1.肝病科，2.藥劑科，湖北 宜昌 443000;3.三峽大學醫學院 藥學系，湖北 宜昌 443000)

急性肝損傷是各種肝臟疾病的發生、發展及最終走向肝功能衰竭的始動環節和共同途徑［1］。急性肝損傷為慢性肝病基礎，可引起急性肝功能受損及病理組織學異常，一直是全球關注的熱點研究方向［2］。臨床研究表明，熊去氧膽酸(UDCA)對于慢性肝病具有良好的治療效果，其主要通過無毒性的UDCA 替換或清除毒性膽汁酸，阻止膽管上皮細胞凋亡而發揮作用，在臨床上得以廣泛應用［3－4］。異甘草酸鎂(MgIG)是甘草酸單一立體異構體鎂鹽，在臨床治療多種肝損害均具有較顯著的療效，不良反應少，與其他護肝類藥物聯用，療效可有明顯提高［5－6］。目前有關二者聯用的相關報道較少，本研究通過探討UDCA 聯合MgIG 干預小鼠急性肝損傷的療效，為有效治療慢性肝臟疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性小鼠50 只，18～22 g，購于三峽大學實驗動物中心，合格證號:SYXK(鄂)2011－0061，采用12 h 晝夜交替照明，環境溫度:(22±4)℃，濕度:40%～50%。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑:UDCA 膠囊購自德國福克藥廠;MgIG 購自江蘇正大天晴藥業股份有限公司;丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒、總蛋白含量測定試劑盒、丙二醛(MDA)含量測定試劑盒、總抗氧化能力(TAOC)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶活性(GSH-PX)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

主要儀器:Stat Fax-2100 型酶標儀(單通道)，美國Awareness 公司;U-3010 紫外-可見分光光度計，日本Hitachi High-Technol 公司。

1.3 實驗方法

隨機將50 只小鼠分為空白組、模型組、UDCA組、MgIG組、聯合組5組，每組10 只。給藥組每日分別灌胃給予UDCA 25 mg/kg、MgIG 5 mg/kg、UDCA25 mg/kg+MgIG15 mg/kg，1 次/d，連續3 d，每只0.2 mL，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水。末次給藥1 h 后，空白組腹腔注射生理鹽水0.1 mL/10 g，其余各組腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液0.1 mL/10 g［7］，禁食不禁水，16 h 后摘眼球取血，離心取血清，置4 ℃保存備用;同時立即剖腹取肝臟，4 ℃預冷生理鹽水沖洗，濾紙拭干、稱重，計算肝臟指數(肝重/體重×100%)。其中每只小鼠稱取肝臟小葉0.5 g，加預冷的9 倍體積的0.86%生理鹽水于玻璃勻漿器中勻漿，2500 r/min 離心10 min，上清液置4 ℃保存備用。其余肝組織于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，用水沖洗后經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，進行石蠟包埋處理后切成4 μm 厚的薄片。

1.4 觀察指標

改良賴氏法測定血清ALT、AST，考馬斯亮藍法測定蛋白含量。血清ALT、AST，肝組織MDA含量、SOD、T-AOC、GSH-PX 的測定均嚴格按試劑說明書進行操作。采用蘇木精-伊紅染色、Masson三色染色觀察肝組織變化。

1.5 統計學方法

實驗數據應用SPSS 19.0 處理，定量資料采用均數±標準差()表示，組間均數比較采用單因素方差分析和t 檢驗分析組間差異，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝臟指數

結果見表1。各組肝臟指數比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 對小鼠肝臟指數的影響(，n=10)

表1 對小鼠肝臟指數的影響(，n=10)

2.2 血清生化指標

模型組血清ALT、AST 含量較空白組明顯升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。與模型組比較，UDCA組，聯合組血清中的ALT、AST 含量均有明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.01)，其 中聯合組優于單獨用藥組(P＜0.05 或P＜0.01)。見表2。

表2 對小鼠血清ALT、AST 的影響(，n=10)

表2 對小鼠血清ALT、AST 的影響(，n=10)

與空白組比較* P＜0.05;與模型組比較##P＜0.01;與UDCA組，△P＜0.05;與MgIG組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.3 肝組織勻漿指標

與空白組比較，模型組肝組織MDA 含量升高，SOD、T-AOC、GSH-PX 活性降低(P＜0.01);各給藥組肝組織MDA 含量與模型組比較均有所降低，SOD、T-AOC、GSH-PX 活性有所增加(P＜0.01)，其中聯合組MDA 降低較UDCA組明顯(P＜0.05)。見表3。

2.4 組織病理學觀察

蘇木精-伊紅染色結果顯示:空白組小鼠肝臟結構正常，肝細胞排列整齊有序，未見明顯病變部位，及壞死細胞、成纖維細胞存在;模型組在匯管區可見明顯壞死病灶，肝組織結構發生明顯變化，形成完整假小葉，肝細胞排列混亂，失去正常肝組織所具有的放射狀排列;MgIG組、UDCA組和聯合組肝臟病變程度均明顯減輕，壞死肝細胞明顯減少，脂肪化程度減輕，肝細胞排列紊亂情況有所改善。聯合組效果最佳。見圖1。

表3 對小鼠肝組織中MDA、SOD、T-AOC、GSH-PX 的影響(，n=10)

表3 對小鼠肝組織中MDA、SOD、T-AOC、GSH-PX 的影響(，n=10)

與空白組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，##P＜0.01;與UDCA組，△P＜0.05。

圖1 藥物對小鼠肝組織病變程度的影響 HE 染色，100 倍

Masson 三色染色結果顯示:空白組小鼠肝臟組織正常，無明顯可見膠原沉積;模型組小鼠肝臟中存在大量膠原沉積，且相互連接成網狀;用藥組膠原沉積情況明顯少于模型組，見圖2。

圖2 藥物對小鼠肝組織病變程度的影響 Masson 三色染色，100 倍

對各組肝臟切片采用DMR 顯微圖像分析系統進行膠原沉積面積積分，結果用藥各組小鼠肝組織中膠原組織含量均有一定降低，與模型組比較差異具有統計學意義(P＜0.05 或P＜0.01)，MgIG組、聯合組效果優于UDCA組(P＜0.01)，見表4。

表4 藥物對小鼠肝組織膠原面積的影響(，n=10)

表4 藥物對小鼠肝組織膠原面積的影響(，n=10)

與空白組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與UDCA組，△△P＜0.01。

3 討論

肝損傷是由各種肝臟疾病所產生的病變結果，常見的包括病毒性肝損傷、藥物性肝損傷、酒精性肝損傷和免疫性肝損傷［8］，其主要表現為脂肪肝、膽汁郁積、肝壞死、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等［9］。

UDCA 為膽汁淤積性肝病內科治療的常用藥物。研究顯示，UDCA 對膽管結扎、CCl4、酒精誘導的肝損傷動物模型都有顯著治療作用［10－11］。其作用機制主要通過抑制肝臟氧自由基，減少TNFα 和TGF-β1等細胞因子的產生［12］，誘導肝纖維細胞凋亡發揮保肝作用［13］。MgIG 具有較強的抗炎、保護肝細胞膜及改善肝功能的作用，常用于多種原因所致的肝功能異常［14］，還具有類糖皮質激素的作用，可通過免疫調節等作用降低化療后的不良反應，且能有效減少肝細胞變性、壞死及炎癥細胞浸潤，促進肝細胞再生［15］。

本研究顯示，UDCA、MgIG 能有效提升因注射CCl4而降低的SOD 和GSH-PX 活性，加快肝組織中超氧陰離子的清除速度，保護肝細胞免受過氧化損傷;各給藥組小鼠肝組織T-AOC 提升，說明藥物不僅能促進自由基清除，還能阻斷過氧化鏈，提升小鼠機體整體的對抗氧化應激的水平。UDCA 與MgIG 聯合用藥能顯著降低模型組小鼠血清ALT、AST 水平和過氧化物終產物MDA 的含量，病理學檢查提示聯合用藥組肝細胞變性、壞死及炎細胞浸潤明顯減輕，病變程度明顯降低。表明UDCA、MgIG 具有協同作用，聯合應用對CC14所致小鼠急性化學性肝損傷具有保護作用及抗纖維化作用，其機制可能與其清除自由基、提高抗氧化酶活性等有關。

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