基于口腔黏膜脫落細胞的CYP2C91075A/C 多態性流行病學研究

王 偉，童小文

(上海交大醫學院附屬第九人民醫院 急診科，上海，200011)

華法林(Warfarin)是一種香豆素衍生物，主要是通過抑制細胞內維生素K 環氧化還原酶的活性，阻止了Vit K 的循環利用，同時使得Vit K依賴性的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ不能被有效激活，進而起到抗凝作用，是目前神經內科和心內科等臨床廣泛使用的一種口服抗凝藥物。其中S-華法林(左旋華法林)是臨床使用的消旋華法林的主要成分，目前也是人類對華法林的藥物代謝研究也集中于此型［1］。華法林主要經細胞色素P4502C9(Cytochrome P450，CYP 2C9)代謝，在亞州和中國漢族人中主要以CYP 2C91075A＞C 突變最為多見。臨床［2－5］發現CYP 2C91075A＞C多態性突變與個體間華法林劑量差異化密切相關。因此明確CYP 2C91075A＞C 多態性突變對指導臨床用藥有非常重要的意義，本研究旨在進一步探明CYP 2C91075A＞C 多態性在中國人群中的分布情況，為華法林藥物在臨床中合理規范使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 病例來源

上海交大醫學院附屬第九人民醫院急診科門診及病房中隨機選擇需常規口服華法林藥物的江西漢族患者680例，其中男370例，女310例，年齡在40～68歲，平均57歲，所有入選患者簽知情同意書后納入研究。

1.2 主要實驗儀器及試劑

Rotor-Gene 6000 熒光PCR 儀(Corbett Life Science 公司，美國)，ABI 3730 xl 測序儀(ABI 公司，美國)，高保真PCR MIX(凡濟，上海)，DNA Marker 及口拭子DNA 提取試劑盒(凡濟，上海)，口拭子采樣拭子(凡濟，上海)。

1.3 樣本采集及DNA 提取

所有入選患者清水漱口后，用口拭子采樣拭子在兩頰內側分別上下刮取15 次，采樣后置于試劑盒保存液后室溫保存，3 個月內按照凡濟公司口拭子核酸抽提試劑盒說明書進行DNA 提取，用紫外分光光度計對所提取的DNA 進行定量和純度檢測，－20 ℃冰箱保存備用。

1.4 CYP 2C91075A＞C 突變檢測

1.4.1 PCR 引物設計與合成:F:序列5'-TGCACGAGGTCCAGAGATGC-3，產物長度131 bp;R:序列5'-AAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3。

1.4.2 PCR 反應體系:每個0.2 mL eppendorf 管中依次加入以下反應液:2.5 μL 模板，10 μL 5×PCR 緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，250 mmol/L KCl，50 mmol/L MgCl 25 mmol/L EDTA，5 mmol/L NAD+，0.5%(v/v)Triton X－100)，1 μL 熱啟動酶，5 μL 引物混合液(每條引物濃度 為1 μL mol/ L)，5 μL 10 × Eva Green，26.5 μL 去離子水，總反應體系為50 μL。混合后在Rotor-gene 6000 定量PCR 儀進行擴增，反應條件為:95 ℃預變性5 min，95 ℃變性20 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，共30 個循環。

1.4.3 限制性內切酶消化及電泳分型檢測:PCR 反應結束后經2% 瓊脂糖凝膠電泳，Gold View 核酸染料染色檢測得到預期大小的片斷后，再進行下一步酶切反應;酶切反應體系30 μL，含PCR 產物10 μL，限制性內切酶1.5 μL，10X 酶切緩沖液3 μL，混勻后置37 度消化4 h，用4%瓊脂糖凝膠電泳，Gold View 核酸染料染色后分析結果。

酶切結果判定:根據引物設計，PCR 產物大小應為131 bp，如為野生型，則被切為110 bp 和21 bp 兩段，但由于21 bp 片段較小，在瓊脂糖檢測時難以顯示，所在當采檢個體為野生型時純合子顯示110 bp 一條帶，如為突變純合子則只顯示131 bp 一條帶，雜合子則可顯示110 bp 和131 bp兩條帶。

1.5 數據分析

用SPSS 13.0 軟件分析CYP 2C91075A＞C基因型及等位基因頻率分布情況。

2 結果

CYP2C9 基因只有AA(610例)和AC(70例)兩種基因型被發現，未見CC 型，分布頻率分別為89.71% 和10.29%，等位基 因A 的頻率 為94.85%，等位基因C 的頻率為5.15%。PCRRFLP 檢測結果示意圖見圖1。

圖1 PCR-RFLP 檢測結果示意圖

3 討論

近年來藥物遺傳學研究進展迅速，人們已經越來越認識到藥物代謝的種族及個體差異性與藥物代謝相關基因的多態性關系密切。其中CYP2C9 作為細胞色素P450 酶家族中的重要成員，是肝微粒體中重要的藥物代謝相關酶，大量研究［3－5］表明CYP2C9 基因具有遺傳多態性。目前研究最多的有三種基因型，分別是野生型CYP2C9* 1，突變型CYP2C9* 2(430C＞T)和突變型CYP2C9* 3(1075A＞C)。近年來研究［3］表明，CYP2C9 多態性頻率存在明顯的人種差異性，總體來說白種人較黃種人和黑種人存在更高的突變率，且有些突變類型只存在于某個或某幾個人群中，在白種人和土耳其人群中2/3 的個體為野生型純合子，1/3 個體是* 2 或* 3 的雜合子，小于2.5%的個體是* 2* 2，* 2* 3 或* 3* 3 基因型的攜帶者;而在美國黑人和東亞人群中未發現CYP2C9* 2 等位基因［6］;在國內除在新疆維吾爾族中檢測到CYP2C9* 2 等位基因(頻率為3%)以外，其他研究［7］中均未發現CYP2C9* 2的等位基因，因此本研究重點針對CYP2C9* 3 即1075A/C 進行檢測，入選病例中未發現1075A＞C純合突變體，只檢出1075A 與C 雜合突變的患者70例，等位基因頻率為10.92%，略高于之前耿啟彬等2012年報道的廣東地區的7.9%［8］，但低于何震宇2006年報道的心臟瓣膜置換術后長期服用華法林病人的18.18%，這與之前得到的CYP2C9 突變存在人種差異的結論是一致的。

從口腔頰黏膜脫落細胞中獲取DNA 并進行基因檢測有許多的優勢:①無創性，可有效避免采血的痛苦，便于對小孩、老人或某此抗拒取血，如某些精神疾病患者等進行基因樣本的采集;②簡便易行，只需口拭子和離心管即可;③可提供足量的DNA，即往報道的實驗中單拭子得率可達0.5～5 μg，本實驗中所采用的凡濟生物改進后的單拭子得率可達5～15 μg［9］，可滿足基本上所有后續的基因學檢測;④可以較長時間的保存，加上保存液后可室溫放置3 個月仍能提取出完整的基因組。因此通過口拭子刮取口腔頰黏膜脫落細胞這種非侵入性方法來獲得DNA，能最大限度的減少被檢者的痛苦［10－11］。當然，口拭子刮取口腔頰黏膜脫落細胞所得的DNA 不可避免的會有可能混有食物或是口腔內細菌的污染，這些外來DNA 如果與所檢測基因有重疊或相似序列時，則可能會干擾檢測結果，隨著目前基因檢測技術敏感性和特異性的不斷提高，通過優化引物可很好的解決外來DNA 的干擾問題。

本研究表明CYP2C91075A/C 等位基因在中國人群中有比較高的分布頻率，由于之前研究已經表明攜帶有該突變的個體服用華法林時更易出現藥物毒副作用，因此臨床上在使用華法林藥物時應進行CYP2C9 基因分型檢測，有利于指導臨床合理使用華法林藥物，降低毒副作用的發生，對臨床個性化用藥具有一定的指導作用，而基于口腔黏膜脫落細胞這一無創采樣方式將有利于該項檢查的大范圍推廣實施。

［1］International Warfarin Pharmacogenetics Consortium，Klein T E，Altman R B，et al.Estimation of the warfarin dose with clinical and pharmacogenetic data［J］.N Engl J Med，2009，360(8):753.

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［4］耿啟彬，蔡佳琳，黃思玲，等.華法林藥物遺傳學基因CYP2C9 和VKORC1 單核苷酸多態性在文東漢族人群的分布研究［J］.分子診斷與治療雜志，2012，4(6)，371.

［5］陳曉英，彭齊，胡大清，等.CYP2C9 及VKORC1 基因多態性對華法林穩態劑量和模型預測劑量的相關性研究［J］.華中科技大學學報:醫學版，2015，44(1):92.

［6］Limdi N A，Arnett D K，Goldstein J A，et al.Influence of CYP2C9 and VKORC1 on warfarin dose，anticoagulation attainment and maintenance among European-Americans and African-Americans［J］.Pharmacogenomics，2008，9(5):511.

［7］唐和年，杜宇奎，張總剛.新疆維吾爾族分健康人群細胞色素P450 基因多態性研究［J］.中國藥物與臨床，2007，7(2):91.

［8］牛國平，魏園園.CYP2C9 和VKORC1 基因多態性與華法林劑量關系的研究［J］.檢驗醫學，2014，6:635.

［9］韓躍峰，李磊，王曉雯，等.口腔黏膜拭子在遺傳性耳聾常見致病基因檢測中的應用研究［J］.解剖與臨床，2012，(05)，381.

［10］徐玉樂，周海英，徐軍，等.從口腔黏膜拭子提取基因組DNA 進行年齡相關性黃斑變性易感基因的檢測［J］.中華眼科雜志，2012，48(2):114.

［11］董睿，劉毅，趙冬梅，等.頰黏膜拭子檢測孤獨癥譜系障礙兒童相關基因多態性的臨床應用［J］.中國神經精神疾病雜志，2014，40(7):424.