細胞外基質重構與炎癥性腸炎的相關性分析

盧 平，高世蓉

(湖北省荊州市中心醫院，湖北 荊州，434020)

結腸炎是臨床上的常見病，是指各種原因引起的結腸炎癥性病變，表現為腹痛、腹瀉、膿血便及黏液便等［1－2］。炎癥性結腸炎是病理及病因機制尚未完全闡明的自身免疫性疾病，主要是由環境因素、腸道菌群及食物抗原或半抗原引起的腸屏障性功能異常［3－4］。基質金屬蛋白酶是細胞內降解膠原蛋白IV 的最主要的酶，基質金屬蛋白酶及其抑制劑通過調節細胞外基質的降解與重構參與了細胞內的多種病理及生理過程，且與消化系疾病密切相關［5－6］。本研究對本院診治的炎癥性結腸炎患者進行分析，探討細胞外基質重構與炎癥性腸炎相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對本院診治的炎癥性結腸炎患者進行分析，所有患者均經過臨床癥狀、內鏡、放射檢查和病理診斷進行確認。80例患者中男44例，女36例，年齡31～68歲，平均年齡(44.5±6.8)歲。80例患者中有35例潰瘍性結腸炎患者，45例克羅恩病患者。以40例本院同期健康體檢者為對照組。排除妊娠、血栓、肝炎、糖尿病、腫瘤及炎癥反應的患者。各組患者在性別比例、平均年齡等方面無顯著差異(P＞0.05)。

1.2 檢測項目

本研究比較對照組、潰瘍性結腸炎組及克羅恩病組患者血清中 MMP2、MMP9、TIMP1及TIMP2的表達;比較3組患者血清中炎癥因子IL-2、IL-6 及IL-10 水平的變化。

1.3 Real time PCR 檢測相關指標表達

mRNA 提取及逆轉錄均按照說明書進行。Real-Time PCR 反應條件:95 ℃熱啟動10 min;94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，72℃收集熒光，共37個循環。反應體系為20μL:cDNA 2 μL;Forward Primer(10 μM)0.5 μL;Reverse Primer(10 μM)0.5 μL;2.5 ×SYBR Green(TianGen)8;sterile water 9 μL。引物序列:β-actin forward 5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3';reverse:5'-CAGGAGGAGCAATGATCTT-3';MMP2 forward:5'-AAAGACAGCTCCTCCTCGAAGGTT-3';reverse:5 ' -TGACCAAATCCCCATTTACGC-3 ' ;MMP -9 forward :5 ' -CGACATAGACGGCATCC AG-3';reverse:5'-CTGTCGGCTGTGGTTCAGT-3';TIMP1 forward:5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3';reverse:5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3';TIMP2 forward:5'-GGTGCCTTCGCTGATGCACTG-3';reverse:5'-ATCGCGCTCGCCTTGGCTATG-3'。

1.4 ELISA 檢測相關蛋白表達

EILSA 檢測試劑盒均購自美國OMEGA 公司。患者抽取靜脈血后3000 rpm 離心3 min，分離上層血清4 ℃保存，待用。ELISA 法進行蛋白含量測定均嚴格按照說明書操作。

1.5 統計學處理

數據統計采用SPSS 20.0 統計軟件完成，計量資料用單因素方差分析，計量資料用平均數±標準差表示，計數資料采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 炎癥性腸炎患者MMP2 表達情況分析

本研究發現，與對照組相比，潰瘍性結腸炎和克羅恩病患者的血清MMP2 蛋白和mRNA 水平均明顯增高，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，見圖1。

圖1 炎癥性腸炎患者MMP2 蛋白及mRNA 表達情況分析

2.2 炎癥性腸炎患者MMP9 蛋白和mRNA表達分析

本研究發現，與對照組相比，潰瘍性結腸炎和克羅恩病患者的血清MMP9 蛋白和mRNA 水平均明顯增高，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，見圖2。

圖2 炎癥性腸炎患者MMP9 蛋白及mRNA 表達情況分析

2.3 炎癥性腸炎患者TIMP1 蛋白的表達情況分析

本研究發現，與對照組相比，潰瘍性結腸炎和克羅恩病患者的血清基質金屬蛋白酶抑制劑TIMP1 蛋白和mRNA 水平均明顯降低，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，見圖3。

圖3 炎癥性腸炎患者TIMP1 蛋白及mRNA 表達情況分析

2.4 炎癥性腸炎患者TIMP2 蛋白表達分析

本研究發現，與對照組相比，潰瘍性結腸炎和克羅恩病患者的血清基質金屬蛋白酶抑制劑TIMP2 的表達明顯降低，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，見圖4。

圖4 炎癥性腸炎患者TIMP2 蛋白及mRNA 表達情況分析

2.5 炎癥性腸炎患者血清白細胞介素表達情況分析

本研究發現，與對照組相比，潰瘍性結腸炎和克羅恩病患者的血清炎癥因子IL-2、IL-6 及IL-10的水平均明顯增高，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，見表1。

3 討論

炎癥性結腸炎是臨床上的常見病和多發病，嚴重影響患者的生活質量。其中潰瘍性結腸炎發病于結腸，臨床上主要表征為彌漫性黏膜炎癥，在隱窩或固有層有中性粒細胞的浸潤反應，甚至會導致黏膜潰瘍［7－9］。克羅恩病多見于小腸和結腸發病，但也可能發病于從口腔至肛門的任何部位［10－11］。本研究分析細胞外基質重構與炎癥性腸炎相關性時發現，與對照組相比，潰瘍性結腸炎患者和克羅恩病患者MMP2、MM9 的表達均明顯增高，TIMP1 及TIMP2 的表達均明顯降低，且炎癥因子IL-2、IL-6 及IL-10 的水平明顯增高，且均與對照組相比有顯著差異。因此，細胞外基質降解與重構及白細胞介素家族炎癥因子參與了炎癥性結腸炎的發病過程。

基質金屬蛋白酶及其抑制劑介導的細胞外基質降解與重構過程參與機體內的多種生理及病理性過程。在研究MMP14 在結腸癌組織中的表達及意義時發現，MMP14 的表達與結腸癌的分化程度、淋巴結轉移、腫瘤大小、浸潤深度、Dukes 分期及脈管浸潤等具有相關性，且可以作為判斷結腸癌是否轉移和浸潤的指標［12］。在分析結腸直腸腺瘤和結腸直腸腺癌組織中MMP2 的表達及意義的研究中也證實，MMP2 的表達與結腸癌的發生及發展相關，且其表達也與結腸癌的轉移和預后不良相關，是臨床評價結腸癌復發、轉移及不良預后的重要標志物［13］。同時，在對復方青黛顆粒對潰瘍性結腸炎模型大鼠治療作用的研究中也證實藥物主要通過抑制MMP1 和TIMP1 的表達發揮治療三硝基苯磺酸誘導的潰瘍性結腸炎大鼠模型的作用［14］。本文中也發現，與對照組相比，潰瘍性結腸炎患者和克羅恩病患者MMP2、MM9 的表達均明顯增高，TIMP1 及TIMP2 的表達均明顯降低，提示細胞外基質的降解過程促進了炎癥性結腸炎的發病過程，此過程中伴隨著基質金屬蛋白酶活性增強和其抑制劑活性的降低。

白細胞介素也參與了結腸的多種病理過程。在分析潰瘍性結腸炎患者血清和結腸組織IL-8和IL-10 的表達時發現IL-8 水平明顯增高而IL-10 水平明顯降低，提示炎癥反應的失衡是潰瘍性結腸炎發病的重要原因［15］。分析三黃湯灌腸對實驗性潰瘍性結腸炎結腸組織白細胞介素水平變化的研究中也發現藥物主要通過抑制IL-1β 的表達改善結腸黏膜的充血水腫、潰瘍及糜爛，發揮三硝基苯磺胺誘導的潰瘍性結腸炎的治療作用［16］。在分析烏梅丸對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織治療的實驗中也發現烏梅丸主要通過下調IL-8 和上調IL-13 達到治療潰瘍性結腸炎的目的［17］。本研究也發現，與對照組相比，潰瘍性結腸炎和克羅恩病患者的血清炎癥因子IL-2、IL-6及IL-10 的水平均明顯增高，且與對照組比較有顯著差異，這與上述研究結論相一致。因此，細胞外基質降解與重構及白細胞介素家族炎癥因子參與了炎癥性結腸炎的發病過程。

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