To ll樣受體5激動劑CBLB502對7.0Gy 60Co γ射線照射恒河猴的輻射防護(hù)作用觀察

申星，熊國林，謝玲，郭玲玲，李明，趙艷芳，王磊，洪劍，楊萌，趙黎，彭瑞云，王勇，楊曉明，羅慶良，余祖胤，葛常輝，邢爽

近年來，To ll樣受體(To ll-like recep to r，TLR)信號通路的調(diào)控已成為研究熱點[1]，目前已研發(fā)出多種TLR激動劑用于抗感染、抗腫瘤以及治療自身免疫性疾病[2]。基于刺激TLR、調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號通路發(fā)揮抗輻射損傷作用的研究發(fā)現(xiàn)了一系列新的輻射防護(hù)劑[3-5]，其中以TLR5激動劑的作用最強(qiáng)，能同時防護(hù)骨髓和腸道的輻射損傷，對重度以上骨髓型放射病有較好的輻射防護(hù)作用[5]。TLR5廣泛表達(dá)于樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及腸黏膜固有層內(nèi)皮細(xì)胞的表面，能夠被細(xì)菌鞭毛蛋白或其衍生物CBLB502識別，并激活NF-κB信號通路，從而抑制細(xì)胞凋亡、抵抗機(jī)體氧化損傷[6]。CBLB502是經(jīng)過改構(gòu)的鞭毛蛋白衍生物，高效且免疫原性低，研究表明其對致死劑量照射的小鼠和獼猴均有顯著的保護(hù)作用[5,7-8]。為進(jìn)一步探索CBLB502的輻射防護(hù)作用，本研究以恒河猴為模型動物，采用輻射防護(hù)效果較好的WR-2721(氨磷汀，阿米福汀)[9]作為陽性對照藥物，觀察了不同劑量CBLB502對7.0Gy60Co γ射線全身照射恒河猴的防護(hù)作用，旨在為CBLB502的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只健康成年恒河猴購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所，雌雄各半，體重5.0±1.0kg[動物質(zhì)量合格證號：SCXK-(京)2005-0005]。動物飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心普通級猴實驗室內(nèi)，24h負(fù)壓通風(fēng)換氣，室溫18～24℃，相對濕度40%～70%，10h日光燈照明，14h黑暗，每天沖洗清潔籠具2次。動物到達(dá)后單籠單養(yǎng)，除飼以軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心配制的猴用標(biāo)準(zhǔn)飼料外，適當(dāng)給予新鮮水果蔬菜等加強(qiáng)營養(yǎng)，消毒涼水置籠內(nèi)自由飲用。動物飼養(yǎng)設(shè)施合格證號：SYXK-(軍)2007-004。動物實驗均按照軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物倫理委員會要求執(zhí)行。

1.2 分組 依據(jù)性別、體重和外周血白細(xì)胞計數(shù)將入選的30只恒河猴分為對癥治療組、WR-2721組和CBLB502 2.5、10、40μg/kg組，每組6只。此外，預(yù)備3只體重為6～12kg的健康成年恒河猴用作對癥治療中輸血時的供血猴。

1.3 給藥方法 CBLB502注射液由北京放射醫(yī)學(xué)研究所研制，批號20100613，4.0m g/支(1.0m l)，為無色澄明水溶液。WR-2721由大連美羅大藥廠生產(chǎn)，白色凍干粉劑，400m g/瓶，批號53090902。不同劑量CBLB502和WR-2721均于照射前0.5h一次肌肉注射，對癥治療組肌肉注射等體積生理鹽水(0.3m l/kg)。

1.4 模型制備與對癥支持治療 采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所的60Co γ射線放射源，照射前10m in用3%戊巴比妥鈉(30m g/kg)靜脈注射麻醉恒河猴，將麻醉猴固定于特制照射木箱內(nèi)行7.0Gy一次全身雙側(cè)照射，照射距離為4.75m，照射劑量率為13.00～13.52cGy/m in。為防止照射動物在觀察期內(nèi)過早死亡影響實驗結(jié)果，依實驗動物倫理及福利要求，受試動物在相同原則下均給予綜合對癥治療，主要措施包括抗感染、抗出血、輸血、維持水電解質(zhì)和酸堿平衡、補(bǔ)充營養(yǎng)等。腸道滅菌：自照前3d開始，給予慶大霉素16萬U+甲硝唑0.4g口服，1次/d，連續(xù)3d。預(yù)防感染：動物外周血白細(xì)胞數(shù)低于1×109/L時開始使用抗生素(青霉素80萬U/d，肌肉注射，頭孢噻肟鈉1.0g/d，靜脈注射)，根據(jù)病情及時調(diào)整、更換，連續(xù)3d外周血白細(xì)胞數(shù)超過1×109/L時停藥。條件輸血：動物外周血小板(PLT)低于50×109/L時，隔天一次靜脈輸注新鮮全血30m l，輸注前均經(jīng)15Gy60Co γ射線照射。

1.5 觀察指標(biāo) 觀察照射后動物一般體征并檢測外周血象，取照射后1d的外周血細(xì)胞和照射后39d的骨髓細(xì)胞進(jìn)行造血細(xì)胞集落培養(yǎng)。觀察動物存活情況，死亡動物即時解剖、存活動物實驗結(jié)束時采用安樂死方式處死，取胸骨、淋巴結(jié)、小腸進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，上述臟器和組織用中性福爾馬林固定，常規(guī)制片、切片和染色后光鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Orig in Pro 9.0軟件包作圖。計量資料以±s表示，血小板減少癥持續(xù)時間和生存率組間差異比較采用Kap lan-Meier檢驗。外周血細(xì)胞數(shù)比較采用重復(fù)測量的方差分析(repeated m easures data of ANOVA)，造血細(xì)胞集落數(shù)比較采用單因素方差分析(one-w ay ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗或Dunnett t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 7.0Gy γ射線全身照射猴損傷程度 7.0Gy60Co γ射線全身照射后，各組實驗猴造血功能均嚴(yán)重受損，外周血淋巴細(xì)胞數(shù)迅速下降，照射后48h降至0.5×109/L左右，并于照射后第7天開始陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，最高體溫達(dá)40.4℃，發(fā)熱期間動物食欲減退甚至拒食，體重明顯減輕。病程極期，各組實驗猴外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板數(shù)均明顯減少，發(fā)生血細(xì)胞減少癥。對癥治療猴于照射后17d開始出現(xiàn)死亡，其中4只猴在照射后3周內(nèi)死于嚴(yán)重感染和出血并發(fā)癥，存活時間為19.4±1.7d，40d時存活數(shù)僅為2只。對死亡猴進(jìn)行組織病理學(xué)分析見骨髓腔空虛，廣泛出血，造血細(xì)胞顯著減少；脾臟廣泛出血，紅髓白髓分界不清，淋巴細(xì)胞明顯減少，脾小體結(jié)構(gòu)消失；腸黏膜剝脫、出血，黏膜上皮細(xì)胞嗜酸性變，間質(zhì)細(xì)胞減少，淋巴細(xì)胞固縮等。根據(jù)一般臨床表現(xiàn)、造血損傷程度和存活情況，參考急性放射病的分型分度標(biāo)準(zhǔn)[10]，本實驗條件下，7.0Gy γ射線全身照射猴發(fā)生了重度骨髓型急性放射病。

2.2 CBLB502對7.0Gy γ射線照射猴存活和體征的影響 7.0Gy60Co γ射線照射后各組實驗猴均出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，體重呈下降趨勢。CBLB502 2.5、10、40μg/kg組發(fā)熱動物數(shù)少于對癥治療組，除其中1只實驗猴在照射后36d死于皰疹病毒引發(fā)的感染外，其他動物全部存活。WR-2721組照射后17d因外周血小板嚴(yán)重減少死亡1只，對癥治療組照射后40d內(nèi)死亡4只，死亡動物存活時間為19.4±1.7d(表1)。該結(jié)果表明，照射前0.5h單次肌肉注射CBLB502可明顯提高7.0Gy γ射線全身照射所致重度急性放射病實驗猴的存活率，改善其生存質(zhì)量。

表1 7.0Gy γ射線全身照射恒河猴體征及存活情況(n=6)Tab. 1 Signs and survival of Rhesus monkey irradiated with 7.0Gy γ-ray (n=6)

2.3 CBLB502對7.0Gy γ射線照射猴外周血小板數(shù)的影響 CBLB502治療組血小板數(shù)在照射后早期有一過性下降，在照射后2～7d明顯低于對癥治療組(P＜0.05)，各組照射猴外周血小板數(shù)自照射后第5天開始急劇下降，第13～15天達(dá)最低值，CBLB502 10μg/kg和40μg/kg組最低值明顯高于對癥治療組(P＜0.05，表2)，CBLB502 40μg/kg組血小板減少和缺乏(血小板數(shù)＜50×109/L，為臨床輸血指征)持續(xù)時間明顯低于CBLB502 2.5μg/kg組和WR-2721組(P＜0.05，表3)。WR-2721組血小板數(shù)變化趨勢與

表2 CBLB502對7.0Gy γ射線照射恒河猴外周血細(xì)胞數(shù)最低值的影響(×109/L，±s)Tab. 2 Effects of CBLB502 on peripheral b lood nad irs of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (×109/L, ±s)

表2 CBLB502對7.0Gy γ射線照射恒河猴外周血細(xì)胞數(shù)最低值的影響(×109/L，±s)Tab. 2 Effects of CBLB502 on peripheral b lood nad irs of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (×109/L, ±s)

(1)P＜0.05 com pared with IR group; (2)P＜0.05 com pared with WR-2721 group. PLT. Platelets; WBC. White b lood cells; NEUT. Neutrophil;LYM. Lym phocytes

Hem ocyte IR WR-2721 CBLB502 (μg/kg)2.5 10 40 PLT 14.7±9.4 28.8±9.3 33.6±8.9 47.5±13.0(1) 53.7±38.2(1)WBC 0.2±0.1 0.4±0.1 0.4±0.2 0.6±0.2(1) 0.8±0.7(1)NEUT 0.01±0.01 0.03±0.03 0.02±0.02 0.09±0.07 0.13±0.15(1)(2)LYM 0.19±0.14 0.31±0.10 0.15±0.03(2) 0.33±0.10(1) 0.25±0.12

表3 CBLB502對7.0Gy γ射線照射恒河猴外周血血小板數(shù)的影響(±s)Tab. 3 Effects of CBLB502 on peripheral blood p latelet count of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

表3 CBLB502對7.0Gy γ射線照射恒河猴外周血血小板數(shù)的影響(±s)Tab. 3 Effects of CBLB502 on peripheral blood p latelet count of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

(1)P＜0.05 com pared with WR-2721 group; (2)P＜0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg g roup. Recovery initiation tim e w as the tim e point when PLT＞100×109/L began to occur. Since 4/6 Rhesus monkeys in the IR group died during the crisis period, the duration of the PLT nad ir w as no t ca lcu lated.

Group Du ration of PLT nad ir (d)PLT recovery in itiation (d)＜100×109/L ＜50×109/L WR-2721 5.4±1.3 3.2±1.3 20.2±2.3 CBLB502 2.5μg/kg 12.2±5.8(1)4.8±3.9 21.0±2.0 CBLB502 10μg/kg 5.0±4.0(1)1.3±1.9(1)(2) 21.3±8.7 CBLB502 40μg/kg 3.8±2.8(1)1.3±1.6(1)(2) 15.5±8.3

CBLB502 2.5μg/kg組相似，恢復(fù)稍快于對癥治療組。照射后39d各組血小板數(shù)相當(dāng)，達(dá)照射前水平的56%～76%(圖1A)。

2.4 CBLB502對7.0Gy γ射線照射猴外周血白細(xì)胞數(shù)的影響 CBLB502 10μg/kg和40μg/kg組照射猴外周血白細(xì)胞數(shù)最低值均明顯高于對癥治療組(P＜0.05，表2)，且開始恢復(fù)時間提前(圖1B)。CBLB502 40μg/kg組白細(xì)胞數(shù)在照射后13d明顯高于WR-2721組和對癥治療組(P＜0.05)，15～17d明顯高于對癥治療組(P＜0.01)，其白細(xì)胞數(shù)減少和缺乏(白細(xì)胞數(shù)＜1.0×109/L)持續(xù)時間明顯低于CBLB502 2.5μg/kg組和對癥治療組(P＜0.05，表4，圖1B)。中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)變化趨勢(圖1C、D)與白細(xì)胞基本一致，CBLB502 40μg/kg組照射后15d

表4 CBLB502對7.0Gy γ射線全身照射恒河猴外周血白細(xì)胞的影響(±s)Tab. 4 Effects of CBLB502 on peripheral b lood WBC count of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

表4 CBLB502對7.0Gy γ射線全身照射恒河猴外周血白細(xì)胞的影響(±s)Tab. 4 Effects of CBLB502 on peripheral b lood WBC count of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

Group Du ration of WBC nad ir (d)WBC recovery in itiation (d)＜2.0×109/L ＜1.0×109/L WR-2721 16.2±3.1 12.0±3.2 21.4±2.6 CBLB502 2.5μg/kg 17.8±2.6 12.8±3.3 22.6±2.2 CBLB502 10μg/kg 16.3±3.3 10.5±5.2 21.0±2.8 CBLB502 40μg/kg 12.5±6.4(1) 7.0±5.8(1)(2) 20.0±2.8

(1)P＜0.05 com pared with WR-2721 group; (2)P＜0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg group. Recovery initiation tim e was the tim e point when WBC＞2.0×109/L began to occur. Since 4/6 Rhesus monkeys in IR group died during crisis period, duration of WBC nadir w as no t ca lcu lated中性粒細(xì)胞數(shù)明顯高于對癥治療組和WR-2721組(P＜0.05)，CBLB502 40和10μg/kg組照后各時間點的淋巴細(xì)胞絕對值相當(dāng)，且在照射后17d均明顯高于對癥治療組(P＜0.01，P＜0.05)。該結(jié)果提示，照射前0.5h單次肌肉注射CBLB502可促進(jìn)7.0Gy γ射線全身照射恒河猴外周血白細(xì)胞數(shù)恢復(fù)，以40μg/kg組效果最佳，其療效優(yōu)于WR-2721。

圖1 CBLB502對7.0Gy γ射線全身照射恒河猴外周血細(xì)胞數(shù)的影響Fig. 1 Effect of CBLB502 on peripheral b lood cells coun t of the Rhesus monkeys irrad iated with 7.0Gy γ-ray A. Plate let; B. Leucocyte; C. Neu troph il; D. Lym phocyte; E. Eryth rocyte; F. Reticu locyte

2.5 CBLB502對7.0Gy γ射線照射猴外周血紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞(RET)數(shù)的影響 恒河猴外周血紅細(xì)胞數(shù)在照射后緩慢下降，極期時CBLB502 10、40μg/kg組紅細(xì)胞數(shù)較其他各組略低(圖1E)。外周血中RET數(shù)可以間接反映受照射機(jī)體造血功能損傷程度及恢復(fù)情況，檢測結(jié)果表明：7.0Gy γ射線照射后9 d內(nèi)各組RET絕對值無明顯差異，對癥治療組RET低值持續(xù)至第21天才開始逐漸恢復(fù)，而CBLB502治療組外周血RET于照射后9～15d有小幅升高且高于同期對癥治療組，第15天后CBLB502 2.5μg/kg組與對癥治療組恢復(fù)速度相當(dāng)，但CBLB502 10、40μg/kg組迅速上升并明顯高于同期CBLB502 2.5μg/kg組、對癥治療組及WR-2721組(P＜0.05，圖1F)。該結(jié)果提示，照射前0.5h單次肌肉注射CBLB502可加速7.0Gy γ射線全身照射恒河猴造血功能的恢復(fù)。

2.6 CBLB502對7.0Gy γ射線照射猴骨髓和外周血造血細(xì)胞集落形成的影響 照射后1d外周血造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)結(jié)果顯示，CBLB502治療組巨核細(xì)胞集落形成單位(co lonyform ing unit-m egakaryocyte，CFU-MK)、紅系爆式集落形成單位(bu rst-fo rm ing un it-eryth roid，BFU-E)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位(colonyform ing unit-granulocyte m acrophage，CFU-GM)集落數(shù)均有所增加，但是受樣本數(shù)量所限，僅CBLB502 2.5μg/kg組CFU-GM集落數(shù)優(yōu)于對癥治療組、WR-2721組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表5)。第39天骨髓造血集落培養(yǎng)結(jié)果顯示，各組集落生成數(shù)相當(dāng)，提示此時存活照射猴的造血損傷均已得到恢復(fù)(表6)。

表5 7.0Gy γ射線照射后1d各組外周血細(xì)胞集落形成單位數(shù)(/2×104單個核細(xì)胞，±s)Tab. 5 Colony counting in peripheral b lood of the anim als 1-day after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 m ononuclear cells, ±s)

表5 7.0Gy γ射線照射后1d各組外周血細(xì)胞集落形成單位數(shù)(/2×104單個核細(xì)胞，±s)Tab. 5 Colony counting in peripheral b lood of the anim als 1-day after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 m ononuclear cells, ±s)

CFU-MK. Co lony form ing unit-m egakaryocyte; BFU-E. Burstform ing unit-erythroid; CFU-E. Colony form ing unit erythroid; CFU-GM.Colony form ing unit-granulocyte m acrophage; CFU-M ix. M ixed colonyfo rm ing unit. (1)P＜0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg g roup

Group CFU-MK BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-M ix IR 0.6±0.90.5±1.00.1±0.3 4.1±2.8(1)0.1±0.3 WR-2721 0.3±0.40.8±0.9 0.0 5.8±2.8(1) 0.0 CBLB502 2.5μg/kg 1.4±0.70.4±0.40.5±0.9 14.8±6.7 0.5±0.4 CBLB502 10μg/kg 2.0±2.02.9±3.9 0.0 7.2±4.1(1) 0.0 CBLB502 40μg/kg 1.1±0.33.3±3.3 0.0 9.1±5.2 0.6±0.9

2.7 CBLB502對7.0Gy γ射線全身照射恒河猴對癥治療的影響 統(tǒng)計各組動物接受對癥治療的用藥情況發(fā)現(xiàn)，CBLB502 40μg/kg組有2只動物照射后外周血小板數(shù)一直＞100×109/L，不需輸血或接受止血藥治療，另4只動物接受止血藥治療時間較WR-2721組明顯縮短(P＜0.05)，且輸血量較WR-2721組及CBLB502 2.5μg/kg組明顯減少(P＜0.05，表7)。該結(jié)果提示，照射前0.5h單次肌肉注射40μg/kg CBLB502可明顯縮短7.0Gy γ射線全身照射恒河猴接受抗生素和止血藥治療的時間并減少輸血量。

2.8 各組7.0Gy照射猴組織病理學(xué)改變 組織病理學(xué)觀察顯示，照射前0.5h單次肌肉注射CBLB502可明顯減輕7.0Gy60Co γ射線全身照射后骨髓、腸道、腸系膜淋巴結(jié)等組織的損傷，其中CBLB502 10μg/kg和40μg/kg組的改善作用更為突出，主要表現(xiàn)為骨髓、腸道、腸系膜淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)良好，細(xì)胞數(shù)量增加，血管淤血、出血減輕或消失。

表6 7.0Gy γ射線照射后39d各組骨髓血細(xì)胞集落形成單位數(shù)(/2×104單個核細(xì)胞，±s)Tab. 6 Colony counting in bone m arrow of the anim als 39 days after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 mononuclear cells, ±s)

表6 7.0Gy γ射線照射后39d各組骨髓血細(xì)胞集落形成單位數(shù)(/2×104單個核細(xì)胞，±s)Tab. 6 Colony counting in bone m arrow of the anim als 39 days after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 mononuclear cells, ±s)

CFU-MK. Colony form ing unit-m egakaryocyte; BFU-E. Burstform ing unit-erythroid; CFU-E. Co lony form ing unit erythroid; CFUGM. Colony form ing unit-granulocyte m acrophage; CFU-M ix. M ixed co lony-form ing unit. Since 4/6 Rhesus monkeys from IR group died during crisis period, colony counting was not done to bone m arrow

Group CFU-MK BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-M ix WR-2721 8.9±2.814.2±1.95.6±1.994.8±16.05.2±3.1 CBLB502 10μg/kg9.1±1.613.5±1.53.8±1.2102.6±3.72.4±0.4 CBLB502 10μg/kg7.2±1.514.8±3.44.9±1.792.5±13.64.5±2.1 CBLB502 40μg/kg6.5±1.514.1±5.73.9±1.682.4±14.23.6±1.7

表7 各組對癥治療情況(±s)Tab. 7 Sym p tom atic therap ies of experim en tal g roup s (±s)

表7 各組對癥治療情況(±s)Tab. 7 Sym p tom atic therap ies of experim en tal g roup s (±s)

(1)P＜0.05 com pared with WR-2721 group; (2)P＜0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg group. Since 4/6 Rhesus monkeys from IR group died du ring crisis period, sym p tom atic therapy du ration w as no t calcu lated

Item WR-2721 CBLB502 (μg/kg)2.5 10 40 An tibio tics treatm en t du ration (d) 20.2±2.6 20.6±4.2 19.3±3.1 20.3±4.6 Hem ostatic treatm ent duration (d) 8.3±3.0 9.6±2.9 6.7±4.2 4.3±3.7(1)To ta l transfusion vo lum e (m l) 95.0±22.6 75.0±33.2 20.0±15.5(1)(2) 37.5±56.8(1)(2)

骨髓：對癥治療組4只恒河猴在21d內(nèi)死亡，組織病理學(xué)觀察見骨髓腔空虛，廣泛出血，造血細(xì)胞顯著減少，殘留的造血細(xì)胞以成熟細(xì)胞為主，胞核固縮，并見大量含鐵血黃素沉積(圖2A)。WR-2721組可見骨髓腔少量出血，造血細(xì)胞增生，以粒細(xì)胞為主，其結(jié)構(gòu)損傷較對癥治療組有所改善(圖2B)。CBLB502 40μg/kg組骨髓均見造血細(xì)胞增生活躍，形態(tài)良好，核分裂象多見，出血減少(圖2C)。該結(jié)果提示，CBLB502預(yù)防給藥對7.0Gy γ射線全身照射猴的骨髓組織有明顯保護(hù)作用。

腸道：對癥治療組恒河猴腸黏膜脫落、出血，腸腔散在細(xì)胞碎片，黏膜上皮細(xì)胞可見嗜酸性變，間質(zhì)細(xì)胞減少，淋巴細(xì)胞固縮，隱窩未見明顯增生(圖3A)。WR-2721組存活猴腸上皮排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，隱窩和淋巴細(xì)胞增生，有少量出血，其結(jié)構(gòu)損傷較對癥治療組減輕(圖3B)。CBLB502 40μg/kg組恒河猴腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，隱窩明顯增生，淋巴細(xì)胞數(shù)目增加，間質(zhì)細(xì)胞豐富、形態(tài)正常(圖3C)，其結(jié)構(gòu)損傷較對癥治療組和WR-2721組明顯改善。

圖2 7.0Gy照射猴骨髓病理組織學(xué)觀察(HE ×400)Fig. 2 Histopatho logical observation of bone m arrow of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (HE ×400)A. Anim al in IR g roup and d ied on 21d; B. Anim al in WR-2721 g roup; C. Anim al in CBLB502 40μg/kg g roup

圖3 7.0Gy照射猴小腸病理組織學(xué)觀察(HE ×200)Fig. 3 Histopatho log ical observation of sm all in testine of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (HE ×200)A. An im a l in IR g roup and d ied on 21d; B. An im a l in WR-2721 g roup; C. Anim a l in CBLB502 40μg/kg g roup

腸系膜淋巴結(jié)：對癥治療組腸系膜淋巴結(jié)皮質(zhì)變薄，皮髓分界不清，淋巴細(xì)胞顯著減少，核固縮、溶解，可見含鐵血黃素沉積(圖4A)。WR-2721組腸系膜淋巴結(jié)皮髓質(zhì)可見少量淤血、出血，淋巴細(xì)胞壞死和增生并存，可見核碎片和核分裂結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)損傷較對癥治療組有所改善(圖4B)。CBLB502 40μg/kg組恒河猴腸系膜淋巴結(jié)出血減少，皮髓質(zhì)分界清晰，淋巴細(xì)胞增生活躍(圖4C)，其結(jié)構(gòu)損傷較對癥治療組和WR-2721組明顯改善。

圖4 7.0Gy照射猴腸系膜淋巴結(jié)病理組織學(xué)觀察(HE ×200)Fig. 4 Histopathological observation of m esenteric lym ph node of Rhesus monkey irradiated with 7.0Gy γ-ray (HE ×200)A. Anim al in IR g roup and d ied on 21d; B. Anim al in WR-2721 g roup; C. Anim al in CBLB502 40μg/kg g roup

3 討 論

本研究以7.0Gy60Co γ射線全身照射恒河猴為模型動物，觀察了CBLB502對重度骨髓型急性放射病的防護(hù)效果。對動物體征、存活率與存活時間、造血功能的損傷與重建、非造血器官及組織的損傷和修復(fù)等方面進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)：7.0Gy γ射線全身照射后，對癥治療組恒河猴在3周內(nèi)死亡4只，死亡動物存活時間為19.4±1.7d；所有動物均出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，體溫最高達(dá)40.4℃；照射前0.5h單次肌肉注射CBLB502可明顯提高動物活存率，其中2.5μg/kg CBLB502提高存活的效果與30m g/kg WR-2721相同(均存活5/6)；CBLB502 10、40μg/kg組恒河猴全部存活，發(fā)熱動物數(shù)減少，體重下降幅度較對癥治療組有所改善。照前0.5h單次肌肉注射2.5、10、40μg/kg CBLB502均可明顯促進(jìn)7.0Gy γ射線全身照射恒河猴造血功能恢復(fù)，升高外周血白細(xì)胞、血小板和中性粒細(xì)胞數(shù)的最低值，縮短外周血細(xì)胞數(shù)最低值持續(xù)時間并使其開始恢復(fù)時間提前。此外，CBLB502可明顯減輕7.0Gy60Co γ射線照射后骨髓、淋巴結(jié)和腸道等主要造血、免疫和消化器官的組織損傷。照射后39d骨髓造血細(xì)胞集落培養(yǎng)并未觀察到CBLB502可促進(jìn)造血細(xì)胞集落的生成，可能是因為骨髓樣本采集時間較晚，此時各組動物的造血功能均已恢復(fù)正常。本研究結(jié)果顯示，抗輻射損傷作用以CBLB502 40μg/kg組最佳，10μg/kg CBLB502仍具有較好的輻射防護(hù)效果；經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，照前0.5h單次肌肉注射40μg/kg CBLB502對7.0Gy γ射線全身照射恒河猴的輻射防護(hù)作用明顯優(yōu)于國際公認(rèn)的輻射防護(hù)劑WR-2721(照前0.5h單次肌內(nèi)注射30m g/kg)。

TLR是最先被發(fā)現(xiàn)的模式識別受體，在人類固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[11-12]，迄今為止在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)其11個家族成員，且不同的TLR有其相應(yīng)的配體。目前研究發(fā)現(xiàn)，TLR2/6、TLR5以及TLR9的激動劑均能發(fā)揮輻射防護(hù)作用[2-5]，其中細(xì)菌鞭毛蛋白是TLR 5已知的唯一配體。CBLB502是利用大腸埃希菌制備的重組蛋白，包含了沙門菌鞭毛蛋白完整的N末端和C末端保守的結(jié)構(gòu)域，不但可在常溫下長時間保存而不喪失藥物活性，而且與鞭毛蛋白具有同樣的穩(wěn)定性，毒性和免疫原性卻大為較低[5]。利用TLR5基因敲除小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，CBLB502可通過TLR5依賴途徑激活NF-κB信號通路發(fā)揮輻射防護(hù)效應(yīng)，其具體機(jī)制包括：①誘導(dǎo)IAP、Bc l-2表達(dá)，抑制輻射所致的細(xì)胞凋亡；②誘導(dǎo)超氧化物歧化酶2的表達(dá)，促進(jìn)機(jī)體清除氧自由基；③誘導(dǎo)多種具有輻射防護(hù)作用的細(xì)胞因子如G-CSF和IL-6的表達(dá)，刺激白細(xì)胞和血小板的生成[5]。此外，不同于造血刺激生長因子類輻射防護(hù)劑，CBLB502在保護(hù)造血系統(tǒng)的同時，還對消化系統(tǒng)有明確的輻射防護(hù)作用。目前，CBLB502的抗氧化損傷作用已在小鼠腎臟缺血再灌注損傷研究中得到證實[13]。由于對放射性腸道上皮損傷有顯著的治療作用，CBLB502也被用于頭頸部放療所致的皮炎及口腔黏膜炎的實驗治療，可減輕輻射所致的上皮細(xì)胞損傷，且不降低腫瘤細(xì)胞對輻射的敏感性[14]。值得關(guān)注的是，有報道稱CBLB502對放射性間質(zhì)性肺炎和肺纖維化也有明顯的預(yù)防作用[15]。相信隨著研究的不斷深入，CBLB502作為安全、有效的新型輻射防護(hù)劑，可擁有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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