失重對大鼠腎上腺髓質激素分泌及m iRNA-375表達的影響

溫麗君，吳繼華，宋淑軍，王艷茹，劉俊麗，司少艷，崔彥，張建中，周金蓮

機體在失重或模擬失重環境下可出現心血管脫適應癥[1]，主要表現為心動過速、血壓下降甚至暈厥。研究表明，失重或模擬失重條件下的心血管脫適應與機體血液循環中腎上腺髓質激素的變化有關，但具體機制尚不明確[2]。腎上腺髓質激素主要包括多巴胺(dopam ine，DA)、去甲腎上腺素(norep inephrine，NE)和腎上腺素(epinephrine，E)，機體處于安靜狀態時，髓質激素分泌量很少，而處于緊急情況時交感神經興奮，髓質激素分泌可驟然增多，使神經興奮，反應靈敏，供氧、供血增加，血糖升高，糖和脂肪分解加速，以供給更多的能量，提高機體的應激能力。酪氨酸羥化酶(tyrosine hyd roxy lase，TH)是腎上腺髓質激素合成過程中的限速酶，其活性對NE和E的合成起關鍵作用。文獻報道航天員在航天飛行過程中血漿腎上腺髓質激素水平波動明顯且不一致，其在模擬失重條件下的變化亦存在爭議[3-5]。我們前期研究發現，m iRNA-375在腎上腺髓質中表達，而在皮質中不表達。因此，本研究探討模擬失重條件下大鼠血漿腎上腺髓質激素、TH及m iRNA-375表達變化特點，探討其m iRNA-375表達對腎上腺髓質激素合成與分泌的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級W istar成年雄性大鼠56只，體重280～350g，購自中國北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養條件為人工控制22±2℃，12h晝夜光照，自由進食飲水。適應飼養1周后將大鼠隨機分為0h(正常對照組)、6h、12h、1d、3d、5d、7d組(n=8)。采用Morey-Holton尾懸吊法[6]建立模擬失重動物模型，所有操作經醫院動物倫理委員會批準后進行。實驗步驟參照相關文獻報道[7]。實驗前后測量體重。除6、12h組外，其余各組選擇在9:00am取材。利用眼球摘除法取血標本，摘取腎上腺，剝除脂肪，測重，左側腎上腺置于1.5m l EP管中–80℃冰箱保存，右側腎上腺置于pH 7.4多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋。

1.2 大鼠血漿腎上腺髓質激素測定 大鼠懸吊結束后，采用10%水合氯醛行腹腔麻醉，利用眼球摘除法取血，置于含20μl 10% EDTA的滅菌EP管中，室溫靜置30m in，3500r/m in離心10m in，收集上層血漿，–20℃冰箱保存，利用放射免疫分析法測定血漿腎上腺髓質激素含量，所有操作按說明書進行。

1.3 免疫組化檢測腎上腺髓質TH蛋白表達 腎上腺石蠟包埋切片后，采用SABC法行免疫組化檢測。具體步驟如下：切片脫蠟，高溫抗原修復，滅活內源性過氧化物酶，羊血清封閉非特異性抗原，加TH一抗(以PBS為對照)，4℃孵育過夜，加二抗GAR-B(生物素標記的山羊抗兔IgG)室溫孵育3h，加SP-HR室溫孵育2h，DAB試劑盒顯色，脫水封固，顯微鏡下觀察并照相。TH陽性為胞質著色，DAB染色為棕黃色或棕褐色。

1.4 Western blotting檢測腎上腺髓質TH蛋白表達水平 取凍存腎上腺，加入200μl蛋白裂解液，冰上研磨至糊狀，反復凍融6次，每次2m in，4℃條件下12 000r/m in離心60m in，取上清，按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測其濃度并分裝，–80℃保存。SDS-PAGE凝膠電泳，采用半干法將蛋白質轉移至PVDF膜，用脫脂奶粉封閉液封閉2h，稀釋抗體，室溫下與膜孵育2h，TBST快速洗膜6次，稀釋二抗并與膜孵育2h，再次用TBST快速洗滌膜6次，AP試劑盒顯色并照相。

1.5 RT-PCR檢測腎上腺髓質TH m RNA和m iRNA-375表達 根據Gen Bank設計引物序列如下。TH上游引物5'-CCTCCTTGTCTCGGGCTGTA-3'，下游引物5'-GGCGAGCACAGTAATCACCTTC-3'；GAPDH上游引物5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，下游引物5'-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3'；m iRNA-375上游引物5'-AGTGTCGTCAGAAAGAACGAACGGC-3'，下游引物5'-CTCAACTGGTGCGTGGAGTC-3'；U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。m iRNA反轉錄引物序列：m iRNA-375-RT：CTCAACTGGTGTCGTG GAGTCGGCAATTCAATTCAGTTGAGAGCGCACT；U6-RT：AACGCTTCACGAATTTGCGT。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。提取組織RNA反轉錄為cDNA，RT-PCR反應體系為15μl，上、下游引物分別為0.3μl。PCR反應條件為95℃ 30s，95℃5s，60℃ 34s，40個循環。反應結束后記錄Ct值，根據熔解曲線判斷所提取產物的純度并計算TH和m iRNA-375的相對表達水平。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，所有數據采用±s表示，正態分布及方差齊性檢驗后，多個樣本比較采用單因素方差分析，多個均數之間兩兩比較采用LSD-t檢驗或SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血漿腎上腺髓質激素水平測定 尾懸吊模擬失重條件下，大鼠血漿腎上腺髓質激素含量波動明顯，6～12h出現一過性下降，隨后急劇升高，3d形成峰值，之后呈下降趨勢，7d時接近正常對照組水平。E和NE變化趨勢基本一致，但前者反應超前。尾懸吊1～5d大鼠E含量及尾懸吊3～5d大鼠的NE含量顯著升高，與正常對照(尾懸吊0h)之間的差異具有統計學意義(P＜0.05)。DA的波動幅度相對較小，僅3d組的含量與正常對照組之間的差異有統計學意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 模擬失重情況下各組大鼠血漿腎上腺髓質激素含量變化Fig.1 Effect of sim u la ted nu ll g ravity on p lasm a m edu lliad renal ho rm one of rats

2.2 免疫組化染色觀察TH蛋白表達 TH蛋白陽性表達胞質呈棕褐色。正常對照組大鼠腎上腺髓質胞質染色為陽性(圖2A、2B)，6h～1d各組大鼠腎上腺髓質胞質染色加深(圖2C、2D)，3d組染色最強(圖2E、2F)，7d組染色逐漸恢復。陰性對照組腎上腺髓質和皮質的胞核及胞質均未見著色(圖2G、2H)。

2.3 大鼠腎上腺髓質TH m RNA和蛋白表達RT-PCR檢測結果顯示，各組大鼠腎上腺組織TH m RNA表達波動明顯，6h時呈現一過性下降，隨后即上升，1d到達峰值，與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，之后呈下降趨勢，5d時形成谷值，與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，7d時又有所升高。Western b lotting檢測結果顯示，3d時TH蛋白表達水平與對照組比較顯著升高(P＜0.05)，其余各組蛋白表達水平與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。TH m RNA和蛋白表達趨勢一致，但TH蛋白表達強度相對滯后(圖3)。

圖2 免疫組化染色觀察模擬失重大鼠腎上腺髓質內TH蛋白表達(DAB)Fig.2 Exp ression of TH p rotein in ad renal m edulla of rats under simulated null gravity (Immunohistochem istry staining,DAB)

2.4 大鼠腎上腺髓質m iRNA-375表達 各組大鼠腎上腺髓質m iRNA-375表達水平波動明顯，表現為尾懸吊早期(6h)呈一過性顯著升高，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)；隨后快速下降，12h、1d和3d時表達受到明顯抑制，與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)；5d時表達量增加，7d時顯著升高(P＜0.05，圖4)。

3 討 論

航天員飛行及模擬失重環境中腎上腺髓質功能的變化情況，已受到學術界的關注。相關研究證實，航天員在航天飛行過程中血漿及尿腎上腺髓質激素的檢測結果波動明顯且不一致，不僅不同飛行任務中航天員體內腎上腺髓質激素的量升降不一，同一飛行乘組中航天員之間的變化也不盡相同[5,8]。在人體模擬失重實驗中，研究結果則較為一致，表現為血漿或尿中腎上腺髓質激素量下降[9-10]。

圖3 各組大鼠腎上腺髓質TH m RNA(A)和蛋白(B)表達變化Fig. 3 Effect of sim u lated nu ll g ravity on m RNA (A) and p ro tein (B) exp ression of TH in ad renal m edu lla in rats(1)P＜0.05 com pared with 0h (control group); (2)P＜0.05 com pared with 6h group; (3)P＜0.05 com pared with 12h group; (4)P＜0.05 com pared with 1d g roup; (5)P＜0.05 com pared with 3d g roup

圖4 大鼠腎上腺髓質m iRNA-375水平變化Fig.4 Changes of m iRNA-375 exp ression in adrenal medulla of rats(1)P＜0.05 com pared with 0h (con tro l group); (2)P＜0.05 com pared with 6h group; (3)P＜0.05 com pared with 12h group; (4)P＜0.05 com pared with 1d group; (5)P＜0.05 com pared with 3d group;(5)P＜0.05 com pared with 5d g roup

模擬失重條件下大鼠體內腎上腺髓質激素變化的研究結果存在爭議。范全春等[11]研究發現，大鼠尾懸吊21d后血清中NE含量明顯增加，Macho等[12]也有同樣結論，這與陳杰等[13]報道長期尾懸吊大鼠血漿中NE含量明顯下降矛盾，可能與實驗設計、環境、時相、檢測方法等的不同有關。我們的研究結果顯示，大鼠血漿中NE、E水平在尾懸吊早期呈現一過性下降，隨后急劇升高，3d時達高峰，之后下降，至7d時接近正常對照組水平。這種明顯的波動，首先可能與大鼠姿勢改變、體液重新分配、頭部及上肢血液瞬間增加、刺激心肺壓力感受器進而導致交感神經活性暫時受到抑制有關；伴隨持續的失重應激狀態，機體交感神經活性的一過性抑制解除后，腎上腺髓質細胞活性和腎上腺髓質激素的合成及分泌迅速增加；一旦機體從整體到各系統尤其心血管系統對失重環境逐漸適應后，神經內分泌系統包括腎上腺髓質激素的合成和分泌變化則趨向穩定，這種變化符合機體的正常應激反應過程。

Le lkes等[14]研究發現，SD大鼠搭載太空飛船STS-54飛行6h后，其髓質中腎上腺髓質激素下降的同時伴隨TH表達水平的降低，但多巴胺β-羥化酶(dopam ine β hyd roxylase，DBH)及苯乙醇胺N-甲基轉移酶(phenylethanolam ine N-m ethyltransferase，PNM T)水平無明顯改變。本實驗結果表明，大鼠血漿TH m RNA及蛋白在實驗過程中波動明顯，二者之間及與NE和E的變化趨勢基本一致，進一步說明模擬失重早期血漿腎上腺髓質激素的一過性下降和隨后的明顯升高以及后期的變化趨緩均受到TH的嚴密調控。

m iRNA-375最初發現于胰腺β細胞[15]，隨后研究表明其在神經系統、消化系統、呼吸系統、生殖系統、循環系統等組織中均有表達，并通過不同的靶基因抑制下游網狀細胞信號轉導通路而發揮作用，尤其與腫瘤發生發展關系密切[16]。在機體多系統組織的增殖和分化過程中也有重要作用，包括影響脂肪細胞分化、神經突分化、軟骨祖細胞遷移、肺泡上皮細胞轉化等[17-20]。早先有研究發現，m iRNA-375的下游靶基因包括14-4-3、SP1、ERK1/2等，而行使信號網絡樞紐的14-3-3信號蛋白可與TH蛋白相互作用并增強其活性，促進腎上腺髓質激素的合成[21-22]，但m iRNA-375在腎上腺的表達及作用目前尚未見文獻報道。

失重應激狀態及適應過程中腎上腺髓質激素的合成、分泌和TH調節有待深入探討。隨著對m iRNA廣泛作用的認識，結合我們前期實驗研究中偶然發現m iRNA-375在腎上腺髓質中存在的特殊表達情況，本實驗檢測模擬失重條件下大鼠腎上腺髓質中m iRNA-375的表達變化，結果發現實驗大鼠腎上腺髓質m iRNA-375表達水平波動明顯，表現為尾懸吊早期(6h)呈一過性顯著升高，隨后受到迅速而明顯抑制，在較低水平波動，至實驗第5d時表達量增加，7d時顯著升高，其變化趨勢與TH表達水平呈現明顯負相關。結合文獻和本實驗結果，我們推測腎上腺髓質中m iRNA-375在基因水平上通過14-3-3信號蛋白調節(抑制)TH蛋白的轉錄和表達，進而影響腎上腺髓質中腎上腺髓質激素的合成和分泌，其作用機制有待進一步深入研究。

[1] Li ZP, Guo B, Li XO, et al. Changes in Cox-2 exp ression in gastric antrum m uscle layer, serum som atostatin and vasoactive intestinal pep tide levels in sim ulated weightlessness in rats[J].Med J Chin PLA, 2014, 39(5): 383-387. [李正鵬, 郭彪, 李曉鷗, 等. 模擬失重大鼠胃竇肌層Cox-2表達和血清SS及VIP水平的變化[J]. 解放軍醫學雜志, 2014, 39(5): 383-387.]

[2] Wang YC, Wu J, Sun QX, et al. Advances in research about effects of weightlessness or sim ulated weightlessness on cardiovascular system[J]. Acad J Chin PLA Med Sch, 2013, 34(1): 17-19. [王永春, 伍靜, 孫慶喜, 等. 失重或模擬失重對機體心血管系統影響的研究進展[J]. 解放軍醫學院學報, 2013, 34(1): 17-19.]

[3] Blaber E, Mar?al H, Burns BP. Bioastronautics: the influence of m icrogravity on astronaut health[J]. Astrobiology, 2010, 10(5):463-473.

[4] No rsk P. Blood p ressu re regu lation IV: adap tive responses to w eightlessness[J]. Eur J App l Physiol, 2014, 114(3): 481-497.

[5] Macho L, Koska J, Ksinantova L, et al. The response of endocrine system to stress loads during space flight in hum an sub ject[J].Ad v Space Res, 2003, 31(6): 1605-1610.

[6] Morey-Holten ER, Globus RK. The hind lim b un loading rodent m odel: technical aspects[J]. J App l Physio l, 2002, 92(4): 1367-1377.

[7] Wang CY, Wu JH, Song SJ, et al. Exp ression of hypoxia inducing factor-1α in rats' ovary under tail-suspension weightlessness[J].Med J Chin PLA, 2012, 37(9): 868-871. [王春雨, 吳繼華, 宋淑軍, 等. 尾懸吊模擬失重大鼠卵巢組織中缺氧誘導因子-1α表達變化[J]. 解放軍醫學雜志, 2012, 37(9): 868-871.]

[8] Leach CS, Ram baut PC. Endocrine responses in long-duration m anned space fligh t[J]. Acta Astronautica, 1975, 2(1-2): 115-127.

[9] Sam el A, Wegm ann HM, Velvoda M. Response of the circadian system to 6 deg rees head-dow n tilt bed rest[J]. Aviat Space Environ Med, 1993, 64(1): 50-54.

[10] Zhang GM, Liu KJ. The effect of head low bed (HDT-6) on the secrete rhythm icity of hum an urine catecho lam ine[J]. Space Med Med Eng, 1989, 2(2): 129-132. [張光明, 劉克嘉. 頭低位臥床(HDT-6b)對人尿兒茶酚胺分泌晝夜節律的影響[J]. 航天醫學與醫學工程, 1989, 2(2): 129-132.]

[11] Fan QC, Li YZ, Gao JY, et al. The regulation of space yangxin pill to sim u late cardiovascular system of sim ulated weightlessness rats[J]. Manned Space Fligh t, 2013, 19(1): 64-70. [范全春, 李勇枝, 高建義, 等. 太空養心丸對模擬失重大鼠心血管系統的調節作用[J]. 載人航空, 2013, 19(1): 64-70.]

[12] Macho L, Kvetnansky R, Vigas M, et al. Effect of space flights on p lasm a horm one levels in m an and in experim ental anim al[J].Acta Astronau tica, 1991, 23:117-121.

[13] Chen J, Zhang LF, Ma J. A p re lim inary study on p lasm a catecholam ine responses in rats after 3-m onth tail-suspension[J].Chin J Aerosp Med, 1994, 5(1): 31-33. [陳杰, 張立藩, 馬進. 長期尾部懸吊大鼠血漿兒茶酚胺反應性的初步研究[J]. 中華航空醫學雜志, 1994, 5(1): 31-33.]

[14] Lelkes PI, Ram os EM, Chick DM, et al. M icrogravity decreases tyrosine hyd roxylase exp ression in rat ad renal[J]. FASEB J,1994, 8(14): 1177-1182.

[15] Poy MN, Eliasson L, Kru tzfeld t J, et al. A pancreatic isletspecific m icroRNA regulates insulin secretion[J]. Nature, 2004,432(11): 226-230.

[16] Yan JW, Lin JS, He XX. The Em erging ro le of m iR-375 in cancer[J]. In t J Cancer, 2014, 135(5): 1011-1108.

[17] Ling HY, Wen GB, Feng SD, et al. M icroRNA-375 p rom otes 3T3-L1 adipocyte differentiation through m odulation of extracellular signal-regu lated kinase signalling[J]. Clin Exp Pharm aco l Physio l, 2011, 38(4): 239-246.

[18] Abdelm ohsen K, Hutchison ER, Lee EK, et al. m iR-375 inhibits differentiation of neurites by lowering HuD levels[J]. Mo l Cell Bio l, 2010, 30(17): 4197-4210.

[19] Song J, Kim D, Chun CH, et al. M icroRNA-375, a new regulator of cadherin-7, supp resses the m ig ration of chond rogen ic p rogen ito rs[J]. Ce ll Signa l, 2013, 25(3): 698-706.

[20] Wang Y, Huang CQ, Reddy Chintagari N, et al. m iR-375 regulates rat alveo lar ep ithelial cell trans-differentiation by inhibiting Wn t/β-catenin pathw ay[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(6):3833-3844.

[21] Roth D, Burgoyne RD. Stim ulation of catecholam ine secretion from ad renal ch rom affin cells by 14-3-3 p ro teins is due to reorganisation of the cortical actin netw ork[J]. FEBS Lett, 1995,374(1): 77-81.

[22] Skjevik AA, M ilen i M, Baum ann A, et al. The N-term ina l sequence of tyrosine hydroxylase is a con form ationally versatile m otif that binds 14-3-3 p roteinsand m em branes[J]. J Mol Biol,2014, 426(1): 150-168.