中頻脈沖電流經皮刺激肝區對運動性疲勞大鼠肝細胞線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

翟藝宗，黃昌林，常祺，王久清，張佳，郭延嶺

運動性疲勞是指因機體的生理過程不能維持在特定水平或機體不能維持預定的運動強度而導致運動能力下降的現象[1]。肝臟作為人體最大的腺體，在物質代謝、維持機體血糖恒定及供能方面有著重要作用。線粒體是真核細胞功能活動的主要供能單位[2]，可通過其內膜呼吸鏈的氧化磷酸化反應為機體生成80%以上的ATP[3]，在維持肝臟細胞正常的能量代謝和功能方面具有重要作用。線粒體是適應運動方式最為敏感的細胞器之一[4]，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶位于線粒體內膜中[5]，能維持線粒體膜電化學梯度[6]，是線粒體功能、結構變化的靈敏指標。本研究采用游泳力竭大鼠模型，應用分子生化技術探討脈沖電流經皮刺激肝區對運動性疲勞大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響，以進一步探討脈沖電流經皮刺激肝區緩解疲勞的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇健康8周齡雄性W istar大鼠72只，體重204±15g，由河南省實驗動物中心提供，飼養室溫度23±2℃，濕度41%±15%，自然光照，分籠飼養，自由攝食及飲水。實驗前適應性喂養1周。所有動物實驗前均未進行過游泳運動。

1.2 主要試劑及儀器 線粒體超微量Na+-K+-ATP酶及Ca2+-M g2+-ATP酶測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶生物技術有限公司)；鹽酸氯胺酮注射液(國藥準字H35020148，福建古田藥業有限公司)；LD5-2A離心機(北京雷勃爾離心機有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立及分組 將實驗動物隨機分為安靜對照組(A組)、疲勞對照組(B組)、疲勞前刺激組(C組)、疲勞后刺激組(D組)，每組18只。按組別分籠飼養。實驗開始前3d，每只大鼠每天學習游泳30m in，水溫32±1℃，水深70cm，隨后連續進行5周實驗。B、C、D組大鼠每周進行游泳訓練6d，休息1d，每日游泳2次，每次均達到力竭，當

大鼠浮在水面不運動時用木棒驅趕，維持其運動狀態。力竭標準以大鼠下沉后10s不露出水面為準，記錄每只大鼠的游泳力竭時間。每組大鼠游泳后換水。B、D組大鼠在游泳后，C組大鼠在游泳前分別給予腹腔注射鹽酸氯胺酮注射液0.25g/kg麻醉。C組大鼠在游泳前、D組大鼠在游泳力竭后分別以頻率為1024Hz的脈沖電流刺激肝區，電流強度均為10m A，間動周期為1s，時間均為20m in，2次/d。1.3.2 取材、標本制備及指標檢測 各組大鼠分別在1、3、5周末分批斷頭處死，每組各時間點6只，處死前動物禁食水過夜。大鼠處死后立即剖腹取肝臟組織1g，用液氮迅速冷凍保存備用。肝臟標本溶化后仍保持2～8℃的溫度，眼科剪剪碎后，加入9m l PBS液(pH 7.4)，用超聲勻漿器將標本充分勻漿，3000r/m in離心20m in，收集上清液，分裝后待檢測，整個操作過程均在0～4℃下進行。采用分光光度法[7]測定1、3、5周各組動物的肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，應用UV-2450紫外/可見分光光度計檢測其吸光度(A)值，波長636nm，其結果用μkat/g表示。采用Brad food蛋白定量法測定[8]進行大鼠肝臟線粒體蛋白定量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 運動性疲勞大鼠游泳力竭時間的比較 第1周末3組大鼠游泳力竭時間差異無統計學意義(P＞0.05)。第3、5周末D組大鼠游泳力竭時間均明顯長于B組和C組(P＜0.05)，而B組與C組比較差異無統計學意義(P＞0.05，表1)。

2.2 各組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的比較 第1周末4組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較差異無統計學意義(P＞0.05)。第3、5周末B組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于其余3組，且C組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于D組，差異均有統計學意義(P＜0.05，表2)。

表1 運動性疲勞大鼠游泳力竭時間(m in，±s，n=6)Tab. 1 The exhaustive sw imm ing tim e of exercise-induced fatigued rats (m in, ±s, n=6)

表1 運動性疲勞大鼠游泳力竭時間(m in，±s，n=6)Tab. 1 The exhaustive sw imm ing tim e of exercise-induced fatigued rats (m in, ±s, n=6)

(1)P＜0.05 com pared with group B; (2)P＜0.05 com pared with g roup C

Group Training tim e (w eek)1 3 5 B 94.59±8.51 101.72±7.23 111.59±8.42 C 93.80±10.89 105.46±9.89 119.18±10.27 D 97.26±11.62 115.35±12.19(1)(2)132.39±9.44(1)(2)

表2 各組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較(μkat/g，±s，n=6)Tab. 2 Com parison of the hepatic m itochond rial Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activity in the rats (μkat/g, ±s,n=6)

表2 各組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較(μkat/g，±s，n=6)Tab. 2 Com parison of the hepatic m itochond rial Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activity in the rats (μkat/g, ±s,n=6)

(1)P＜0.05 com pared with g roup A; (2)P＜0.05 com pared with g roup B; (3)P＜0.05 com pared with g roup C

Group Na+-K+-ATPase Ca2+-Mg2+-ATPase 1st w eek A 1.179±0.263 1.143±0.187 B 1.128±0.226 1.127±0.156 C 1.181±0.237 1.133±0.162 D 1.284±0.271 1.184±0.171 3rd w eek A 1.165±0.233 1.137±0.151 B 1.015±0.241(1) 1.017±0.161(1)C 1.251±0.219(2) 1.242±0.158(2)D 1.528±0.242(2)(3) 1.487±0.155(2)(3)5 th w eek A 1.183±0.257 0.148±0.164 B 0.915±0.227(1) 0.875±0.153(1)C 1.308±0.224(2) 1.327±0.160(2)D 1.631±0.257(2)(3) 1.592±0.151(2)(3)

3 討 論

線粒體是細胞有氧代謝的重要場所[9]，氧化磷酸化是機體內重要的能量來源，由線粒體內膜的呼吸鏈完成。線粒體氧化磷酸化的關鍵是線粒體內膜功能及通透屏障的完整性[10-11]。Ca2+在調控線粒體功能及ATP合成過程中起著重要作用[12]，刺激氧化磷酸化是其最基本的功能之一。根據M ithell提出的化學滲透假說，呼吸鏈位于線粒體內膜的外側，當H+在膜外側堆積時，會導致膜內外的跨膜電位差，這是線粒體氧化磷酸化過程中發生的根本態勢。此種化學電位差被膜上的ATP酶有效利用，可以從Pi+ADP合成ATP。同時，化學電位差導致了線粒體Ca2+內流，隨著Ca2+內流增加，線粒體內膜陽離子凈增加，導致內膜去極化，為了保持內膜的去極化狀態，線粒體通過生物氧化以加快H+外排。Ca2+內流可破壞線粒體生物氧化的過程，使機體合成ATP的能力下降。

目前有研究發現，有氧運動可以提高線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性[4]。力竭運動可導致大鼠肝臟自由基產生增多，脂質過氧化嚴重，肝臟MDA含量增加，酶的活性降低[13]。本研究結果表明，脈沖電流經皮刺激運動性疲勞大鼠肝區可以提高肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，而線粒體Na+-K+-ATP酶的活性增高可減少線粒體水鈉潴留，減輕線粒體腫脹，此外，Na+-K+-ATP酶除了可維持跨膜的電化學鈉、鉀離子梯度以外，還可降低線粒體內游離鈣濃度，減輕線粒體鈣超載[14]。

本課題組前期研究表明，脈沖電流經皮刺激運動性疲勞大鼠肝區能夠降低肝組織Bax的表達，提高Bc l-2的表達，維護肝組織的正常結構[13]。采用頻率為1024Hz的脈沖電流刺激(電流強度10m A，間動周期1s)可加速乳酸代謝，提高運動耐力，減輕運動性疲勞導致的肝損傷[15-17]。本研究結果顯示，第3周末、第5周末D組大鼠游泳力竭時間均明顯長于B組和C組(P＜0.05)，而B組與C組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，表明脈沖電流經皮刺激運動性疲勞大鼠肝區可以提高其運動耐力及運動成績。A組、C組及D組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在第3、5周末均高于B組，差異有統計學意義(P＜0.05)，表明脈沖電流經皮刺激運動性疲勞大鼠肝區可以提高其活性水平，增強線粒體氧化磷酸化，降低線粒體內游離鈣濃度，從而緩解運動性疲勞。

綜上所述，運動性疲勞可以降低肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，脈沖電流經皮刺激運動性疲勞大鼠肝區可以提高其活性水平，降低線粒體內游離鈣濃度，并減少線粒體鈣超載，刺激氧化磷酸化，提高運動耐力及運動成績，加速機體運動性疲勞的消除。此外，運動性疲勞的發生及消除是一個非常復雜的過程，盡管目前的研究已經取得了較大進展，但對于肝臟線粒體與運動性疲勞之間的確切關系還需要進一步深入探討。

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