蛋白激酶C-β抑制劑LY333531對1型糖尿病大鼠腎功能的影響*

伍婷婷 曾 吉 張百芳 葉 鳳

蛋白激酶C-β抑制劑LY333531對1型糖尿病大鼠腎功能的影響*

伍婷婷1曾 吉1張百芳2葉 鳳2

目的：觀察蛋白激酶C(PKC)-β抑制劑LY333531對1型糖尿病大鼠腎功能的保護作用。方法：27只SD大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病組和LY組，每組各9只。后兩組采用一次性尾靜脈注射60mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)成功構建1型糖尿病模型。LY組大鼠給予PKC-β抑制劑LY333531(10mg/kg/天)灌胃治療8周。抽取各組大鼠頸動脈血并留取24h尿液，測量血糖、內生肌酐清除率和24h尿蛋白。之后處死各組大鼠，摘取腎臟稱重并計算腎重/體重。統(tǒng)計學分析各組上述指標的差異。結果：與正常對照組比較，糖尿病組和LY組大鼠的體重均明顯減輕，而腎重、腎重/體重、血糖及24h尿蛋白均顯著升高(P<0.05)；LY組大鼠的腎重/體重、內生肌酐清除率及24h尿蛋白水平均低于糖尿病組(P<0.05)，兩組腎重、體重和血糖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論：PKC-β抑制劑LY333531有利于改善1型糖尿病大鼠內生肌酐清除率和減少蛋白尿的產生。

糖尿病； 蛋白激酶C-β抑制劑LY333531； 腎功能； 大鼠

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病危害性最大的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制極為復雜。在1型和2型糖尿病患者中，高血糖是導致DN發(fā)生的一個重要原因。長期高血糖環(huán)境可誘導細胞內糖基化終末代謝產物增加，氧化應激、多元醇通路以及蛋白激酶C(Protein Kinase，PKC)信號途徑激活。而這些病理途徑又相互影響、逐級放大，最終發(fā)展至終末期腎病[1]。因此，抑制PKC活化可能是減少腎臟損害、防治DN發(fā)生的策略之一。本實驗以鏈脲佐菌素(STZ)誘導SD大鼠1型糖尿病模型后，應用PKC-β抑制劑LY333531對模型大鼠進行灌胃治療，觀察其腎功能改變，為PKC-β抑制劑治療DN提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器

200-250g雄性SD大鼠(武漢大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK 2008-0004)。STZ(美國Sigma公司，貨號S0130)，PKC-β抑制劑LY333531(美國禮來公司，貨號A1401)，血糖檢測試劑盒(德國西門子公司，批號07193)，肌酐檢測試劑盒(武漢長新盛生物技術有限公司，批號071504017)，尿蛋白測定試劑盒(德國西門子公司，批號19018)，其它試劑均為國產或進口分析純。自動生化分析儀(德國西門子公司，型號Advial 2400)。

1.2 1型糖尿病大鼠模型的構建和分組

27只SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)一周后，采用隨機抽簽法分為三組：正常對照組、糖尿病組和LY組，每組各9只。糖尿病組和LY組采用一次性尾靜脈注射60mg/kg STZ(以0.1mol/L、pH 4.5的無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為溶劑)構建1型糖尿病模型，對照組注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72h后測其血糖濃度>16.7mmol/L，為1型糖尿病造模成功[2]。糖尿病組和LY組18只大鼠均造模成功。成模后，LY組灌胃給予PKC-β抑制劑LY333531(10mg/kg，以0.9%氯化鈉注射液為溶劑，1次/天)，連續(xù)8周。正常對照組和糖尿病組灌胃等量生理鹽水。每天測定血糖、體重，記錄大鼠的飲食和飲水量。

1.3 觀察指標和方法

1.3.1 24h尿肌酐和尿蛋白：三組大鼠均在處死前兩天進入代謝籠，收集24h尿液，準確記錄24h尿量，充分混勻后取5ml保存于-20℃冰箱，檢測24h尿蛋白和尿肌酐含量。

1.3.2 血糖、血肌酐和內生肌酐清除率：實驗結束前大鼠禁食12h，經戊巴比妥鈉麻醉后頸動脈取血，離心，收集血清保存于-20℃冰箱中，檢測血糖和血肌酐含量，并計算內生肌酐清除率(ml/min)[=尿肌酐×每分鐘尿量/血肌酐]。

1.3.3 腎重/體重：實驗結束后處死大鼠，迅速取出腎臟，去除包膜，生理鹽水沖洗干凈后吸干表面水分，無菌稱重，計算腎重/體重。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

實驗結束時各組大鼠各指標差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與正常對照組比較，糖尿病組和LY組大鼠體重減輕(t=-28.957、-28.671，P<0.05)，腎臟重量增加(t=4.293、3.060，P<0.05)，腎重/體重升高(t=5.870、5.513，P<0.05)，血糖水平升高(t=24.284、14.325，P<0.05)，24h尿蛋白增加(t=12.964、9.702，P<0.05)。糖尿病組大鼠的內生肌酐清除率高于正常對照組(t=3.717，P<0.05)。而LY組大鼠腎重/體重、內生肌酐清除率和24h尿蛋白水平低于糖尿病組(t=-2.421、-2.684、-3.730，P<0.05)，且內生肌酐清除率水平與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義(t=1.184，P>0.05)。糖尿病組與LY組腎重、體重和血糖水平差異無統(tǒng)計學意義(t=1.226、1.657、0.065，P>0.05)。見表1。

3 討 論

近年來隨著糖尿病發(fā)病率逐年上升，DN已成為世界范圍內引起終末期腎病的首要原因[3]，其主要病理特征表現(xiàn)為腎小球濾過功能降低、腎小球足細胞損傷、大量蛋白尿、系膜基質增多、進行性腎小球纖維化等[4]。但DN的發(fā)病機制仍不十分清楚，糖代謝紊亂、血流動力學異常、細胞因子過表達都可能參與DN的發(fā)生和發(fā)展[5]。目前臨床治療DN的主要方法是控制血糖和血壓，但其療效存在一定的局限性。因此，尋找更有效的防治DN的方法十分必要。

表1 8周后各組大鼠相關指標水平

注：與正常對照組比較，1)P<0.05；與糖尿病組比較，2)P<0.05

有研究發(fā)現(xiàn)糖代謝異常和血流動力學變化均可促進腎臟PKC的表達，參與DN的病理過程[1]。高血糖誘導的氧化應激與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關，而氧化應激引起尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Dinucleotide Phosphate，NADPH)氧化酶大量激活，誘導產生過量活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的過程依賴于PKC的活化[6]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PKC大約有12種結構和底物不同的異構體，其中研究最多的是傳統(tǒng)型PKC 亞基(PKC-α和PKC-β)。活化的PKC-β可通過各種信號轉導途徑上調腎臟多種細胞因子的表達，包括血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、轉化生長因子-β1(Tansforming Growth Factor-β1，TGF-β1)等[7,8]。已有研究表明TGF-β1和VEGF是參與腎小球細胞外基質大量積聚、腎小球纖維化以及蛋白尿形成過程中重要的細胞因子[9]。Ohshiro等[10]研究發(fā)現(xiàn)敲除實驗小鼠PKC-β基因能夠明顯減輕糖尿病小鼠腎臟的氧化損傷，下調多種細胞因子(內皮素-1、TGF-β、VEGF及結締組織生長因子)的表達、改善腎小球結構異常、減少蛋白尿的發(fā)生。因此提示，抑制PKC-β活化和表達在一定程度上可延緩糖尿病腎臟結構和功能的病理改變。

LY333531是一種PKC-β亞基選擇性抑制劑，本實驗通過建立糖尿病大鼠模型觀察了LY333531對糖尿病大鼠腎功能的保護作用。結果顯示，糖尿病大鼠經LY333531灌胃治療8周后，其內生肌酐清除率和24 h尿蛋白明顯低于糖尿病組，提示LY333531可減少糖尿病大鼠尿蛋白排泄，改善腎功能紊亂。其作用可能與LY333531通過抑制PKC-β活化，減少腎臟氧化損傷，下調細胞因子表達，減輕腎臟纖維化和蛋白尿有關[11]。另外，本實驗還發(fā)現(xiàn)LY組大鼠的腎重/體重低于糖尿病組，提示LY333531對早期糖尿病腎臟肥大有一定的抑制作用。上述結果與Kelly等[12,13]報道LY333531通過抑制PKC活化，下調腎組織中VEGF及TGF-β1表達，改善糖尿病大鼠蛋白尿和腎臟病理變化，以及LY333531能夠抑制糖尿病腎臟氧化應激，通過抑制NADPH氧化酶和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性，減少ROS產生，發(fā)揮對腎臟保護作用[14]相符合。

綜上所述，PKC活化在DN的病理過程中起重要作用。本文結果表明應用PKC-β抑制劑LY333531治療后，糖尿病大鼠腎功能有所改善，為臨床治療和預防DN提供了實驗依據。但DN發(fā)病機制極其復雜，LY333531作用靶標和機制尚需進一步研究。

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本文第一作者簡介：

伍婷婷(1987-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向為糖尿病腎病的分子機制

1 Noh H, King GL. The role of protein kinase C activation in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int Suppl, 2007, 72(106):S49-53.

2 Wu SZ, Peng FF, Li JL, et al. Akt and RhoA activation in response to high glucose response to high glucose require caveolin-1 phosphorylation in mesangial cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2014, 306(11):1 308-1 317.

3 Atkins RC, Zimmet P. Diabetic kidney disease:act now or pay later[J]. Saudi J Kidney Dis Transpl, 2010, 21(2):217-221.

4 Satirapoj B. Nephropathy in diabetes [J]. Adv Exp Med Biol, 2012, 771:107-122.

5 李 競, 毛拓華. 糖尿病微血管病變[J]. 微循環(huán)學雜志, 2013,23(2):1-4.

6 Giacco F, Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complication [J]. Circ Res, 2010, 107(9):1 058-1 070.

7 Xia L, Wang H, Munk S, et al. Reactive oxygen species, PKC-β1, and PKC-δ mediate high-glucose-induced vascular endothelial growth factor expression in mesangial cells[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2007, 293(5):E1 280-1 288.

8 Wu D, Peng F, Zhang B, et al. PKC-beta1 mediates glucose-induced Akt activation and TGF-beta1 upregulation in mesangial cells[J]. J Am Soc Nephrol, 2009, 20(3):554-566.

9 Ziyadeh FN. Different roles for TGF-beta and VEGF in the pathogenesis of the cardinal features of diabetic nephropathy[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2008, 82(Suppl 1):S38-41.

10 Ohshiro Y, Ma RC, Yasuda Y, et al. Reduction of diabetes induced oxidative stress, fibrotic cytokine expression, and renal dysfunction in protein kinase C-beta null mice[J]. Diabetes, 2006, 55(11):3 112-3 120.

11 沃冠群, 姚源璋. PKCα、PKCβⅠ與早期糖尿病腎病關系[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志, 2013,22(1):106-108.

12 Kelly DJ, Buck D, Cox AJ, et al. Effects on protein kinase C-beta inhibition on glomerular vascular endothelial growth factor expression and endothelial cells in advanced experimental diabetic nephropathy[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 293(2):F565-574.

13 Kelly DJ, Zhang Y, Hepper C, et al. Protein kinase C beta inhibition attenuates the progression of experimental diabetic nephropathy in the presence of continued hypertension[J]. Diabetes, 2003, 52(2):512-518.

14 高 霞, 葉 鳳, 周赤燕, 等. PKC-β抑制劑LY333531對糖尿病腎臟NADPH氧化酶與SOD蛋白表達的影響[J]. 首都醫(yī)科大學學報, 2011, 32(3):392-396.

氫氣飽和生理鹽水抑制ROS/ NF-κB通路激活、減輕重癥急性胰腺炎大鼠腎損傷

本刊副主編，武漢大學人民醫(yī)院王衛(wèi)星教授(通訊作者)指導石喬(第一作者)等在《Mediators of Inflammation》(2015，Article ID 685043，3區(qū)，IF=3.236)發(fā)表了題為“Hydrogen-rich saline attenuates acute renal injury insodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis by inhibiting ROS and NF-κB pathway”的研究論文，主要內容如下：

1 研究背景和目的：氫氣能夠選擇性地清除羥自由基(·OH)及過氧亞硝基陰離子(ONOO-)，不影響機體內正常新陳代謝發(fā)生的氧化還原反應及活性氧(ROS)參與的細胞信號通路。重癥急性胰腺炎時機體內大量ROS的產生及其激發(fā)的炎癥級聯(lián)反應，可損傷腎功能，甚至引起腎衰竭。本研究通過靜脈注射氫氣飽和生理鹽水(HRS)，觀察其對重癥急性胰腺炎大鼠腎損傷的保護作用，并探討其保護機制。

2 主要方法：雄性Wistar大鼠72只，隨機分為假手術組(SO組)、重癥急性胰腺炎組(SAP組)和HRS治療組(HRS組)，每組24只。膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉制備重癥急性胰腺炎模型。HRS組在造模成功后5min尾靜脈注射HRS(6ml/kg),并皮下HRS補液(20ml/kg)。SO組、SAP組造模成功后5min經尾靜脈注射生理鹽水(6ml/kg),并皮下生理鹽水補液(20ml/kg)。術后3、12、24h分批剖殺大鼠，每個時間點8只。分別檢測各組大鼠各時間點血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、白細胞介素1β(IL-1β)及IL-6水平。取新鮮腎臟組織檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及髓過氧化物酶(MPO)水平。取腎臟組織病理切片行光鏡觀察及病理評分。采用免疫組化法檢測3-硝基酪氨酸及核因子-κB(NF-κB)在腎臟組織中的表達。Western Blot檢測NF-κB、IκB、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-10、高遷移率族蛋白1(HMGB1)在腎臟組織中的表達。

3 結果：HRS組大鼠血清AMY水平與SAP組相應時間點差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；HRS組大鼠血清(術后3h的Cr及BUN除外)Cr、BUN、IL-1β及IL-6較SAP相應時間點顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HRS組大鼠腎臟MDA、MPO水平較SAP組相應時間點顯著降低，SOD活性較SAP組相應時間點顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。胰腺的病理評分及腎臟的病理評分較SAP組相應時間點顯著降低(P<0.05)。HRS 12h組腎臟組織中3-硝基酪氨酸、NF-κB(胞核)及TNF-α、HMGB1表達較SAP 12h顯著降低。相反，HRS 12h組腎臟組織中IL-10的表達較SAP 12h顯著升高(P<0.05)。

4 結論：HRS對重癥急性胰腺炎腎損傷具有保護作用，其機制與抗氧化應激、抑制IκB硝化、降解及抑制NF-κB激活，從而減少下游炎性因子的產生有關。

Effects of Protein Kinase C-β Inhibitor LY333531 on Renal Function in Diabetic Rats

WU Ting-ting1, ZENG Ji, ZHANG Bai-fang2, YE Feng2

1Department of Clinical Laboratory, Puai Hospital, Wuhan 430034, China;2Department of Biochemistry, School of Medicine, Wuhan University, Wuhan 430071, China

Objective:To investigate the renoprotective effects of protein kinase C(PKC)-β inhibitor LY333531 in type 1 diabetic rats. Method:Twenty-seven Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into three groups:normal control group, diabetic group and diabetic with LY333531 treatment group. Both of diabetic group and diabetic with LY333531 treatment group rats were injected intraperitoneally with 60 mg/kg streptozotocin (STZ) to induce type 1 diabetes. The LY treatment group rats were treated with LY333531 (10mg/kg/day) for eight weeks by gavage. After carotid artery blood and 24-hour urine of each group collected, blood glucose, creatinine clearance rate and 24-hour urine protein levels were measured. Meanwhile body weight and kidney weight was examined. All the indicators in three groups were analyzed by using statistics. Results:Both diabetic group and LY treatment group rats had higher kidney weight, kidney weight/body weight, blood glucose and 24-hour urine protein levels than normal control group (P<0.05). But body weight in diabetic group and LY treatment group rats were lighter than normal control group (P<0.05).The kidney weight/body weight, creatinine clearance rate and 24-hour urine protein levels of LY treatment group rats were significantly decreased compared with diabetic group (P<0.05). Besides, there was no significant difference in kidney weight, body weight and blood glucose between LY treatment group and diabetic group (P>0.05). Conclusion:The PKC-β inhibitor LY333531 may be used therapeutically to improve creatinine clearance rate and proteinuria of type 1 diabetic rats.

Diabetes; Protein kinase C-β inhibitor LY333531; Renal function; Rat

武漢市衛(wèi)計委科研基金項目(WX13C17)

1武漢市普愛醫(yī)院檢驗科，武漢 430034；2武漢大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，武漢 430071

本文2015-03-23收到，2015-06-12修回

R587.1

A

1005-1740(2015)03-0013-04