糖尿病腎病大鼠血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體與腎臟損傷和細胞凋亡的關系*

徐春艷 趙林雙,2,#

糖尿病腎病大鼠血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體與腎臟損傷和細胞凋亡的關系*

徐春艷1趙林雙1,2,#

目的：探討糖尿病腎病(DN)大鼠血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(AT1-AA)與腎臟組織病理變化和腎小管上皮細胞及腎小球足細胞凋亡的關系。方法：36只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組(NC組，n=6)和DN模型組(DN組，n=30)，DN組大鼠給予高糖高脂喂養聯合小劑量(35mg/kg)鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立DN模型。應用ELISA檢測各組大鼠血清AT1-AA水平，并據此將各組再分為AT1-AA陽性和陰性亞組，檢測各組大鼠血糖(BG)、腎功能指標及腎臟肥大指數(KW/BW)；采用HE染色和透射電鏡觀察各組大鼠腎小管和腎小球病理變化；采用TUNEL法檢測腎小管上皮細胞和腎小球足細胞凋亡。結果：DN組大鼠AT1-AA水平和陽性率明顯高于NC組(P<0.05或P<0.01)。與NC組比較，AT1-AA陽性DN大鼠肌酐清除率(Ccr)顯著降低，BG、腎功能指標及KW/BW明顯升高(均P<0.01)；AT1-AA陰性DN大鼠除BG和KW/BW外，其它指標與AT1-AA陽性DN大鼠差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與NC組比較，AT1-AA陽性DN大鼠均出現腎組織及超微結構病理變化，腎小管上皮細胞和腎小球足細胞凋亡率亦顯著升高(P<0.01)；AT1-AA陰性DN大鼠腎臟未見明顯病變，細胞凋亡率顯著低于AT1-AA陽性DN大鼠(P<0.05)。結論：AT1-AA水平變化與DN大鼠腎小管上皮細胞和腎小球足細胞凋亡有關，可能通過介導細胞凋亡而參與腎臟損害過程。

血管緊張素Ⅱ1型受體；自身抗體；細胞凋亡；糖尿病腎病

隨著糖尿病患病率在全球范圍內的普遍增加，各種并發癥也逐年上升，其中30%-40%的患者有發生糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)的危險。作為糖尿病危險而嚴重的微血管并發癥之一[1]，DN已成為西方國家終末期腎病的首要病因，若不及時診治，最終會成為血液透析甚至腎臟移植的主要原因[2]。深入了解DN的發病機制，尋找有效防治DN的方法一直是糖尿病和腎臟病領域的研究熱點。

自1999年血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(Angiotensin Ⅱ Type 1 Receptor Autoantibody，AT1-AA)首次在先兆子癇患者體內被發現以來[3]，國內外學者相繼在高血壓病和移植排斥反應患者體內觀察到AT1-AA可與血管緊張素Ⅱ1型受體 (Angiotensin ⅡType 1 Receptor，AT1R) 結合，發揮類似AngⅡ的激動效應[4-6]，并能增強機體對AngⅡ的敏感性[7]。作者前期臨床研究[8]已發現，DN患者體內AT1-AA陽性率明顯高于糖尿病患者和正常對照者，且與尿蛋白水平正相關。而且腎小管上皮細胞和腎臟足細胞損傷在DN患者蛋白尿的出現和進程中也起著重要作用[9]，但對AT1-AA介導的腎臟細胞損傷和凋亡的研究目前尚未見報道。因此，本研究通過測定DN大鼠血清AT1-AA水平并分析其與腎臟功能和結構改變，以及與腎小管上皮細胞和足細胞凋亡之間的關系，以明確AT1-AA相關的自身免疫機制在DN進程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡雄性SD大鼠購自武漢大學動物實驗中心，共36只(合格證號42000500001559)。飼養于室溫20-24℃、相對濕度40%-60%環境，自由攝食飲水，12h交替照明。

1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，美國Sigma公司，貨號S0130)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(美國Promega公司，貨號G7360)；血糖(BG)測試盒(北京拜爾迪生物技術有限公司，貨號EBGL-100)，肌酐和尿素氮測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號分別為C011，C013-2)；尿微量白蛋白(UMA)測定試劑盒(桂林英美特生物技術有限公司，批號U88011020)；AT1R抗原多肽和AT1-AA陽性和陰性大鼠血清(華中科技大學附屬協和醫院心血管實驗室)。血糖儀(OneTouch UltraVue型，美國Johnson公司)；多肽自動合成儀(PSSM-8型，日本Shimadzu公司)；分光光度計(752型，上海舜宇恒科學儀器有限公司)；酶標儀(RT-6500型，美國Bio-Rad公司)；全自動生化儀 (UniCelDxC 800型，美國Beckman Coulter公司)；彩色醫學圖文分析系統(HMIAS-2000型，武漢千屏影像技術有限責任公司)；透射電鏡(HITACHIH-7000FA型，日本TOSHIBA公司)。

1.3 DN大鼠模型復制

36只SD大鼠適應性喂養一周后采用隨機數字表法分為正常對照組(NC組，n=6)和DN模型組(DN組，n=30)。NC組大鼠以普通飼料喂養，DN組大鼠以高糖高脂飼料(在普通飼料中加入2.5%膽固醇、0.4%膽酸鈉、10%蔗糖、10%豬油)喂養。4周后，禁食10h，DN組大鼠腹腔注射1% STZ溶液(35mg/kg)；NC組注射等量檸檬酸緩沖液。3天后兩組大鼠均尾靜脈取血檢測隨機BG， 10天后以同樣方法再檢測一次，對末次BG>16.7mmol/L大鼠繼續高糖高脂喂養12周，使其自然進展為DN[10]。NC組6只大鼠均未成模，DN組大鼠成模24只，未成模型1只，死亡5只。

1.4 標本收集與處理

兩組大鼠于成模前1天用代謝籠收集24h尿液，記錄尿量。于成模當天兩組大鼠稱取體重后，10%水合氯醛(0.2ml/100g)腹腔注射麻醉，腔靜脈采血，分離血清，-20℃保存。斷頸處死兩組大鼠，分別摘取雙側腎臟，去除包膜，生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分后用電子天平稱重，計算腎臟肥大指數(KW/BW)[雙側腎臟重量(g)/體重(g)×100%]。將左側腎臟橫向切分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定24h，用作HE染色和TUNEL細胞凋亡檢測；另一份用雙刀法切取小塊腎皮質，2.5%戊二醛固定后常規方法制作電鏡標本。

1.5 血清AT1-AA檢測

采用ELISA檢測血清AT1-AA[11]。將合成的AT1R抗原多肽片段溶于0.1mmol/L的碳酸緩沖液(pH=9.6)中，配成100μg/ml的抗原包被液，每孔100μl的量包被反應，4℃過夜；血清封閉酶標反應孔后加入倍比稀釋1∶40的實驗大鼠血清100μl，37℃反應40min；加入1∶2 000辣根過氧化物酶酶標抗體，37℃反應30min后加底物顯色。實驗中設置AT1-AA陽性和陰性對照，陽性對照為AT1-AA陽性的健康大鼠血清，陰性對照為AT1-AA陰性的健康大鼠血清。當陽性對照出現明顯顏色變化后，每孔加入終止液50μl終止反應，于20min內測定實驗結果。光密度(OD)值測定及結果判斷：在酶標儀上以450nm波長測定OD值。測OD值時以實驗樣本與陰性對照的吸光度之比([樣本OD值-空白對照OD值]/[陰性對照OD值-空白對照OD值])>2.1即判為AT1-AA陽性[11]。

1.6 BG和腎功能指標檢測

大鼠血液標本離心后分離血清，尿液標本離心后取上清液，采用全自動生化儀及配套試劑按說明書測定BG(葡萄糖氧化酶法)、血尿素氮(BUN，脲酶法)、血肌酐(Scr)，尿肌酐(Ucr) (苦味酸法)和24h UMA (免疫比濁法)，并計算肌酐清除率(Ccr)=[Ucr (g/L) / Scr (g/L)]×[24h尿量(ml) / (24h×60min)]。

1.7 腎臟組織學觀察

(1)光鏡觀察：4%多聚甲醛固定的腎臟組織按常規方法梯度脫水、石蠟包埋、切片(5μm)、HE染色，光鏡觀察組織形態學改變。(2)電鏡觀察：2.5%戊二醛固定的腎皮質組織小塊按常規方法梯度脫水、樹脂包埋、超薄切片(50nm)、醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察腎皮質超微結構變化。

1.8 細胞凋亡檢測

采用TUNEL法。將上述石蠟包埋腎組織切片常規脫蠟入水，蛋白酶K室溫下消化，TDT酶反應液37℃濕盒中孵育60min，0.3%的過氧化氫抑制內源性過氧化氫酶，鏈霉親和素辣根過氧化酶室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木素復染。陰性對照采用無TDT酶標記液，其它操作同上。光鏡觀察凋亡細胞呈棕褐色，每張切片選取10個視野，用醫學圖文分析系統計數腎小管上皮細胞和腎小球足細胞凋亡數，計算細胞凋亡率。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 DN組大鼠血清AT1-AA水平和陽性率

血清AT1-AA的水平(OD值)，DN組較NC組顯著升高(t=13.133，P<0.01)。DN組血清AT1-AA陽性15例，NC組僅1例，兩組間陽性率差異有統計學意義(χ2=4.051，P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠血清AT1-AA水平和陽性率

注：與NC組比較，1)P<0.01，2)P<0.05

2.2 各組大鼠BG、腎功能指標及KW/BW比較

與NC組比較，DN組大鼠BG、BUN、24h UMA水平及KW/BW均顯著升高(t分別為21.955、6.818、9.747、8.176，均P<0.01)，Ccr明顯降低(t=6.233，P<0.01)。進一步比較發現，DN組AT1-AA陽性和AT1-AA陰性大鼠BG、BUN、24h UMA水平及KW/BW均較NC組明顯升高，Ccr明顯降低(均P<0.01)；而DN組AT1-AA陽性大鼠除BG和KW/BW外，其它上述指標與AT1-AA陰性DN大鼠水平差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠BG、腎功能指標和

注：與NC組比較，1)P<0.01；與AT1-AA陰性DN組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.3 各組大鼠腎組織變化特征

大體觀，與NC組比較，DN組大鼠腎臟體積增大，質地變硬。光鏡下，NC組AT1-AA陰性大鼠腎臟體積和結構均無明顯變化，AT1-AA陽性大鼠腎小管上皮細胞內偶見空泡變性；DN組大鼠腎小管上皮細胞空泡變性，部分腎小管內有蛋白管型，腎小球體積增大、系膜細胞增多、系膜增寬；AT1-AA陽性大鼠腎臟組織病變較AT1-AA陰性大鼠嚴重。見圖1。

透射電鏡顯示，NC組AT1-AA陰性大鼠腎臟超微結構未見明顯異常(圖2A)。NC組AT1-AA陽性大鼠僅表現為少數腎小管上皮細胞水腫，內質網稍腫脹(圖2B)。DN組AT1-AA陰性大鼠腎小管上皮細胞水腫、內質網腫脹或部分溶解、微絨毛排列紊亂；腎小球基底膜局部增厚，可見足突部分融合(圖2C)。DN組AT1-AA陽性大鼠腎小管上皮細胞嚴重水腫、內質網溶解、胞核濃縮、胞膜破裂、微絨毛排列紊亂，管腔中見大量脫落上皮細胞、部分管腔閉塞；腎小球系膜基質增多、基底膜明顯增厚、足突融合、間隙增寬，偶見腎小球硬化(圖2D)。

2.4 各組大鼠腎小管上皮細胞和腎小球足細胞凋亡率

NC組AT1-AA陽性和陰性大鼠細胞凋亡率比較，差異無統計學意義(t=0.132，P>0.05)。DN組大鼠腎小管上皮細胞和腎小球足細胞均有凋亡，以腎小管上皮細胞凋亡為主。DN組AT1-AA陽性大鼠凋亡率明顯大于AT1-AA陰性大鼠(t=4.127，P<0.01)；DN組總凋亡率明顯大于NC組，差異有統計學意義(t=14.504，P<0.01)，見表3。

2.5 AT1-AA與其它指標相關性

Spearman相關分析顯示，DN組大鼠AT1-AA水平與BUN、24h UMA水平及KW/BW呈顯著正相關(r分別為0.671、0.719、0.679，均P<0.05)，與Ccr無明顯相關性(r=0.512，P>0.05)。DN組AT1-AA陽性大鼠血清AT1-AA水平與細胞凋亡率呈顯著正相關(r=0.733，P<0.01)。

表3 各組大鼠腎小管上皮細胞和腎小球足細胞凋亡率

注：與DN組AT1-AA陰性比較，1)P<0.01；與NC組比較，2)P<0.01

[本文圖1、圖2見封2、插2]

3 討 論

腎素-血管緊張系統(Renin-Angiotensin System，RAS)是體內重要的內分泌系統之一，能有效維持血壓穩定和水、電解質平衡。近20年的研究表明，除經典RAS外，腎臟組織中還存在局部RAS[12]。AngⅡ作為RAS的主要活性肽，在腎臟的基本生理效應主要是由AT1R介導。越來越多的研究證實，AngⅡ通過其靶分子AT1R激活多條信號通路，誘導炎癥反應和細胞外基質合成，在DN進程中起重要作用[13]。

AT1-AA屬于補體結合型IgG1和IgG3類抗體[4]，可與RAS關鍵因子AT1R的胞外第二環肽上的氨基酸序列相結合，發揮類似AngⅡ的激動效應，因其對AT1R的刺激作用不會出現脫敏現象而成為AngⅡ之外的另一條刺激AT1R的通路[14]。目前關于AT1-AA的產生主要涉及兩方面的理論：一方面，各種組織損傷和生理紊亂導致隱蔽抗原暴露，機體自身免疫應答反應激活[15]，如AT1R上游分子AngⅡ濃度升高或胞內信號通路變化所致AT1R的構象和密度改變，均可導致機體AT1-AA產生增多[16-17]；另一方面，與AT1R抗原表位具有同源性的蛋白分子持續存在，則會通過分子模擬誘導AT1-AA產生[18]。

業已證實持續高血糖狀態可使血管內皮細胞過度氧化，導致內皮細胞損傷，表面抗原暴露[19]，進而誘導自身免疫反應；而且腎臟局部RAS激活，系膜細胞合成AngⅡ增多，AngⅡ酶活性降低，局部AngⅡ水平升高[20]，均是DN狀態下AT1-AA產生的主要機制。研究表明，AngⅡ可通過活化AT1R，激活炎癥反應和氧化應激等多條信號通路，介導DN腎臟結構和功能損傷[21]，且AngⅡ拮抗劑能抑制內質網應激相關的腎臟細胞凋亡[22]。據此推測，具有AngⅡ樣效應的AT1-AA也可能與DN時腎臟結構和功能改變及腎臟細胞凋亡有關，但對此研究，目前未見文獻報道。

本研究中，DN組大鼠的BUN和24h UMA水平較NC組增加，Ccr降低，提示在該研究條件下，DN組大鼠腎臟功能明顯減退。對比血清AT1-AA結果發現，DN組大鼠AT1-AA水平及陽性率均高于NC組，且AT1-AA陽性DN大鼠前述各項指標異常變化較AT1-AA陰性大鼠更明顯；進一步相關分析顯示，DN組大鼠血清AT1-AA與BUN、24h UMA水平均呈顯著正相關，從而在實驗動物體內證實AT1-AA與DN腎臟功能損害有關，且與作者前期的臨床觀察結果[23]一致。

為明確AT1-AA對腎臟結構改變和腎臟細胞凋亡的影響，本文分別觀察了NC組和DN組AT1-AA陽性和陰性大鼠腎組織形態改變，超微結構變化及腎臟細胞凋亡的情況。光鏡及透射電鏡結果均顯示，DN組AT1-AA陽性大鼠腎小管上皮細胞水腫、壞死，胞質溶解，腎小球基膜增厚，足突融合程度等均較AT1-AA陰性大鼠嚴重；NC組AT1-AA陽性大鼠偶見腎小管上皮細胞變性，而AT1-AA陰性大鼠的腎臟結構未見異常改變。細胞凋亡檢測發現，DN組大鼠腎臟細胞總凋亡率顯著高于NC組，且DN組AT1-AA陽性大鼠凋亡率明顯大于AT1-AA陰性大鼠；相關分析結果也表明，AT1-AA與腎臟細胞凋亡顯著正相關。上述結果均提示AT1-AA與DN大鼠腎臟細胞結構損害和凋亡關系密切。

已知正常人血清中常存在低效價的生理性自身抗體，主要起著清除自身衰老變性成分，維持機體內環境穩定的作用。但當機體AT1-AA生成增多，自身免疫反應激活，則可對腎臟產生病理性免疫損傷效應。本文NC組中AT1-AA陽性大鼠腎臟結構即出現了輕微損傷。DN狀態下，隨著血清AT1-AA水平升高，AT1-AA介導的自身免疫反應會持續存在，胞內信號轉導通路相繼激活，靶器官的損傷也會進行性加重，本文TUNEL檢測結果即顯示，DN組AT1-AA陽性大鼠腎臟細胞凋亡數量明顯高于AT1-AA陰性大鼠。因此認為，血清AT1-AA可能與DN大鼠腎臟結構改變和腎臟細胞凋亡有關，但其致細胞凋亡的具體機制需進一步研究闡明。

綜上所述，血清AT1-AA在DN大鼠腎臟功能損害中起重要作用，并與DN時腎小管上皮細胞和腎小球足細胞凋亡關系密切，可為臨床中通過AT1-AA檢測對糖尿病患者進行DN早期診斷和早期治療提供理論依據。此外，由于血管緊張素轉換酶抑制劑可以通過減弱自身免疫反應來降低血清AT1-AA水平[24]，因此可針對AT1-AA陽性DN患者進行個體化治療，如給予AT1R拮抗劑或血管緊張素轉換酶抑制劑，阻斷AT1-AA的效應或降低AT1-AA水平來減輕腎臟損害，減少細胞凋亡，保護腎臟功能，起到預防和治療DN的作用。

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本文第一作者簡介：

徐春艷(1991-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向為糖尿病及微血管并發癥

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Relationship between Angiotensin ⅡType 1 Receptor Autoantibody and Kidney Damage and Renal Cells Apoptosis in Diabetic Nephropathy Rats

XU Chun-yan1，ZHAO Lin-shuang1,2,#

1Wuhan Clinical Medical School, South Medical University,Guangzhou 510515,China;2Department of Endocrinology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Command, Wuhan 430070, China;#

Objective: To explore the relationship between angiotensin Ⅱtype 1 receptor autoantibody (AT1-AA) and kidney tissue pathologic changes, and apoptosis of renal tubular epithelial cells and podocytesin diabetic nephropathy (DN) rats.Method: 36 SD rats were randomly divided into normal control group (NC,n=6) and DN model group (DN,n=30). DN model rats were induced by high-sucrose and high-fat diet and intraperitoneal injection of a small dose of streptozotocin (STZ, 35mg/kg). ELISA method was used to test the levels of serum AT1-AA, and respectively divided into AT1-AA positive and negative subgroups according to the ELISA results. The blood glucose (BG), renal function indicators and kidney hypertrophy index (KW/BW) were detected and calculated. HE staining and transmission electron microscope were applied to detect renal tubular and glomerulus pathological changes in all group rats. The apoptosis of renal tubular epithelial cells and podocytes were detected by TUNEL staining. Results: The level and positive rate of AT1-AA in DN group were significantly higher than that in NC group (P<0.01andP<0.05). When compared with NC group, the level of BG, rest of renal function indicators and the ratio of KW/BW in AT1-AA positive DN group were significantly increased, with the creatinine clearance rate (Ccr) decreased (allP<0.01). The levels of all the indicators above except BG in AT1-AA negative DN group were significantly reduced (P<0.05orP<0.01) compared with AT1-AA positive DN group.Comparing with NC group, the kidney and ultrastructure had pathological changes in AT1-AA positive DN group, the apoptosis rate of renal tubular epithelial cells and glomerular podocytes also increased significantly (P<0.01). While no obvious pathological changes were observed in the kidney of AT1-AA negative DN rats,and the cell apoptosis rate of AT1-AA negative DN group were obviously lower than that of AT1-AA positive DN group.Conclusion: These findings indicate that the AT1-AA levels may be related to the apoptosis of renal tubular epithelial cells and glomerular podocytes, and involved in the process of kidney damage.

Angiotensin Ⅱtype 1 receptor;Autoantibody;Cell apoptosis;Diabetic nephropathy

湖北省自然科學基金(2011CHC001)

1南方醫科大學附屬武漢臨床學院，廣州 510515；2廣州軍區武漢總醫院內分泌科，武漢 430070；#

，E-mail:zls7111@aliyun.com

本文2014-10-20收到，2014-12-22修回

R587.2

A

1005-1740(2015)01-0004-06