SD大鼠視網膜微動脈平滑肌細胞分離和消化方法*

邵 珺 孫 尉 姚 勇，# 王如心

SD大鼠視網膜微動脈平滑肌細胞分離和消化方法*

邵 珺1孫 尉2姚 勇1，#王如心3

目的：探討分離、消化SD大鼠視網膜微動脈平滑肌細胞(RMASMCs)的方法。方法：取正常SD大鼠眼球，分離視網膜微動脈，利用不同消化酶消化不同時間后，分離RMASMCs，在倒置顯微鏡下觀察RMASMCs形態，并行免疫組化法鑒定。結果：解剖顯微鏡下成功急性分離視網膜動脈分支,即視網膜微動脈(直徑40.23±5.61μm)。1、2、3號消化酶各消化10-16min，RMASMCs數量逐步增多，16min時最多(13.4±1.3個/低倍視野)，與其它消化時間相比，差異有統計學意義(P<0.05)。倒置顯微鏡下觀察收獲的RMASMCs呈長梭形、細胞膜完整、邊緣光滑；免疫組化染色鑒定其胞漿呈α-action陽性表達。結論：采用急性分離、逐步消化的方法能成功獲取較多數量和較高質量的RMASMCs。

視網膜動脈平滑肌細胞；分離消化；大鼠

動物視網膜微動脈平滑肌細胞(Retinal Microartery Smooth Muscle Cells, RMASMCs) 的獲取是其電生理及細胞內鈣活動等研究所必需，對如何獲得數量較多、質量較好的RMASMCs，國外現有報道的幾種方法及結果各不相同[1,2]，國內尚未見相關研究報道。本實驗采用急性分離SD大鼠視網膜動脈，對其分支(微動脈)采用不同消化酶消化不同時間后計數細胞數量，并進行免疫組化鑒定，為分離出數量較多、質量較穩定的RMASMCs提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：8-12周齡，體重200±30g SD大鼠(江蘇省血吸蟲病防治研究所動物中心提供)30只，雌雄不拘。于室溫18-25℃，相對濕度50%-80%條件下飼養。明暗周期12h，自由攝食、飲水。

1.1.2 實驗器材：SHZ-82水浴恒溫振蕩器(金壇市醫療儀器廠)；SANXIN PHB-3/pH計(上海三信儀表廠)；BT25S電子天平(Sartorius，北京科學儀器廠)；Simplicity 純水系統(Millipore,美國)；SZX10解剖顯微鏡、LG-PS2光源、眼科手術器械及IX71倒置顯微鏡均為日本Olympus公司產品。

1.1.3 實驗試劑：二硫蘇糖醇(43819 BioChemika Fluka，美國)，II型膠原酶(4176 Worthington,美國)，牛血清白蛋白(A3803)、木瓜蛋白酶(P4762)、胰蛋白酶抑制劑(T9128)、彈性蛋白酶(E0258)、HEPES(H4034)、Glucose(G7528)均購自美國Sigma公司。

(1)視網膜動脈保存液(mmol/L)的制備：NaCl 140.0、KCl 5.0、CaCl22.0、D-glucose 5.0、MgCl21.3、HEPES 10.0，用NaOH調pH至7.3[5]。

(2)視網膜動脈消化液的制備：1號消化液：牛血清白蛋白1mg加保存液1ml。2號消化液：木瓜蛋白酶1.5mg、二硫蘇糖醇1mg，加1號消化液1ml。3號消化液：II型膠原酶1mg、胰蛋白酶抑制劑1mg、彈性蛋白酶0.25mg,加1號消化液1ml。0號消化液：II型膠原酶1mg加1號消化液1ml。以上消化液配制好后，以1ml為單位分裝于Eppendorf管中，-20 °C保存，兩周內使用。

1.2 方法

1.2.1 分離視網膜動脈：以1.5%戊巴比妥鈉3ml腹腔注射麻醉。頸椎脫臼法處死大鼠，用眼科鑷及眼科剪取下眼球，放入保存液中，4℃冰箱保存，48h內將眼球置于瓊脂板上固定，在解剖顯微鏡下(×10)左手持眼科顯微無齒鑷,右手持Alcon 15°刀,沿睫狀體扁平部垂直刺入,劃開一個約1/4圈的切口。右手換持角膜剪,沿著劃開的口子將角膜剪開,取下角膜，完整取出晶狀體，暴露玻璃體。繼續在顯微鏡下(×10)找到視網膜動脈主要分支(直徑40.23±5.61μm，即視網膜微動脈，見圖1)，用眼科顯微無齒鑷小心分離，盡量剔除周邊黏附的玻璃體及視網膜組織后置于1ml EP管中。

1.2.2 消化視網膜微動脈：打開水浴恒溫振蕩器(37℃)，將置有視網膜微動脈的EP管放入其中。按照0、1、2、3號消化液(各1ml)先后順序進行消化，0號消化液消化30min，1、2、3號消化液各消化10-16min(根據預實驗每批次的木瓜蛋白酶質量和血管大小進行調整)。消化完成后過濾，離心棄上清，吹散至溶液混濁無組織塊，吸取適量懸液在倒置顯微鏡下觀察，每個樣本取3-5個低倍鏡視野，計數平滑肌細胞。

1.2.3 免疫組化染色： 將上述RMASMCs用適量PBS漂洗，離心棄上清，加少量PBS吹散混勻，吸取適量均勻涂布于經多聚賴氨酸處理的玻片上，室溫風扇吹干，用無水丙酮固定10min，采用免疫組化SABC法，觀察RMASMC胞漿中的a-actin表達。具體步驟按試劑說明書操作：(1)先滴加鼠源α-actin單克隆抗體(1∶50)，4℃冰箱過夜；滴加二抗37℃孵育；滴加三抗37℃孵育20min；加DAB顯色10min，蘇木精復染后，脫水、透明、封片,顯微鏡觀察。胞漿中見染成棕色，并與細胞長軸平行的纖維絲為α-actin陽性表達，亦即平滑肌細胞。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 RMASMCs數量和形態

急性分離的視網膜微動脈，經過0號消化液消化30min，再經過1、2、3號消化液各消化10-16min，所獲得的細胞數量隨消化時間的延長而增加，各消化時間組細胞數量差異有統計學意義(F=5.64，P<0.05)。16min時平滑肌細胞數量明顯多于10-14min各組(q均≥5.17,P均<0.05)。顯微鏡下大多數RMVSMCs呈長梭形，部分呈短桿狀，花生狀；輪廓清晰，胞漿完整，邊緣整齊，符合血管平滑肌細胞形態特征[3]。見圖2A。

表1 消化不同時間獲得的RMASMCs數量(個/低倍鏡視野

注：與其它各時間點相比較，1)P<0．05

2.2 免疫組化鑒定

分離的RMASMCs，經SABC染色后，低倍鏡下觀察胞漿呈棕黃色，細胞核為淡藍色，高倍鏡下可見胞漿內大量呈棕色、并與細胞長軸平行的纖維細絲，肌絲結構清晰可辨，即為α-actin陽性。 見圖2B。

[本文圖1、圖2見封4]

3 討 論

通過作者前期對不同分離和消化條件的摸索，本文總結報道能獲取數量較多、質量較好的RMASMCs的實驗方法，為國內相關研究提供參照。根據作者工作中的經驗和體會，進一步提請注意下列影響因素。

3.1 動物個體差異

SD大鼠視網膜血管的個體差異較大，同一批大鼠，體重相近者,其視網膜動脈口徑可有明顯差異，從血管口徑較小的大鼠分離的RMASMCs在數量和質量上較血管口徑較大者稍差。因為血管口徑不同而長度相同動脈上的平滑肌細胞數量不同，對此只能通過增加實驗動物的數量來減少其對實驗的影響。

3.2 分離消化方法

本文作者最初采用有關文獻中介紹的兩種方法分離消化視網膜動脈，一種是分離視網膜色素上皮層全層進行消化[1]，另一種是將其剪成1/4大小進行消化[2]，均未獲得成功。后來參考分離冠狀動脈的方法[4-7]，在盡可能多的剔除其周邊附著的玻璃體，并且增加針對玻璃體成分的消化步驟后，基本獲得成功。消化酶應該選擇質量更有保證的產品，尤其是最重要的木瓜蛋白酶，每更換一批次的酶，都需要重新調整消化時間，因為木瓜蛋白酶容易受潮，一旦受潮將明顯影響其消化效果。 故消化時間經常是最終影響細胞質量的重要因素，消化時間過長會導致細胞膜受損，但消化時間過短，所獲細胞數量較少。需要根據血管口徑大小及消化酶質量調整消化時間，血管口徑越大，消化所需時間越長，酶的質量越好則消化時間越短[8]。通過反復摸索，本文提示0號消化酶消化30min以后，1、2、3號消化酶各消化16min時所獲得的細胞數量最多、細胞形態較好，且雜質少。

對分離、消化后的細胞尚需進行鑒定，本文采用免疫組化方法觀察所獲細胞胞漿中含有大量棕黃色纖維絲，即α-actin，該陽性反應說明本文分離、消化的細胞是平滑肌細胞。

3.3 溫度

合適的溫度是消化酶工作的重要條件，實驗室溫度應該控制在20℃左右，并且待室溫較為穩定后才能開始消化。水浴箱中溫度要控制在37℃。

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本文第一作者簡介：

邵 珺(1983-)，女，漢族，主治醫師，研究方向：糖尿病視網膜病變基礎與臨床

1 Scholfield CN，Curtis TM. Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina [J]. Microvasc Res,2000, 59 (2):233-242.

2 Ishizaki E, Fukumoto M, Puro DG. Functional KATPchannels in the rat retinal microvasculature: topographical distribution, redox regulation, spermine modulation and diabetic alteration [J]. J Physiol，2009,587(13):2 233-2 253.

3 王如興，蔣文平.正常耐鈣Spraque-Dawley大鼠心室肌細胞分離方法及體會[J].中國心臟起搏與心電生理雜志，2007，21(11):159-162.

4 Lu T, Zhang DM, Wang XL, et al. Regulation of coronary arterial BK channels by caveolae-mediated angiotensin II signaling in diabetes mellitus[J]．Circ Res，2010，106(6):1 164-1 173.

5 王如興,李肖蓉,羊鎮宇,等．大電導鈣離子激活鉀通道對糖尿病大鼠冠狀動脈血管張力的調節[J].中華醫學雜志,2010,90(36): 2 575-2 578.

6 McGahon MK, Zhang XH, Scholfield CN，et al. Selective downregulation of the BK beta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes[J]. Channels (Austin),2007,1(3):141-143.

7 來利紅，王如興，蔣文平．酶消化法急性分離大鼠主動脈平滑肌細胞及其鑒定[J]．蘇州大學學報，2008,28(1):23-25．

8 Cai Q，Zhu ZL, Fan XL，et al．Whole-cell recordings of calcium and potassium currents in acutely isolated smooth muscle cells[J]．World J Gastroenterol，2006,12(25)：4 086-4 088．

Isolation and Digestion Method of Normal Retinal Artery Smooth Muscle Cells of Spraque-Dawley Rat

SHAO Jun1, SUN Wei2, YAO Yong1，#, WANG Ru-xin3

1Department of Ophthalmology；3Depertment of Cardiology, Wuxi People’s Hospital of Nanjing Medical University, Wuxi 214023, China；2Suzhou City Hospital,Suzhou 215000,China;#

Objective: To investigate the isolated and digest approach of retinal microartery smooth muscle cells (RMASMCs) of SD rats.Method: SD rats were sacrificed after taking the eyes, using different digestive enzymes to digest different times,separate retinal microartery. RMASMCs morphology was observed under an inverted microscope and identified by immunohistochemical staining. Results: Acute dissecting microscope successfully separate branch retinal artery that retinal arteriolar diameter was 40.23±5.61μm. No.1,2,3 digestive enzymes to digest each 10 to 16 minutes, RMASMCs gradually increased, to 16 min when the largest number of smooth muscle cells, was 13.40±1.30/low magnification, compared with other digestion time, the difference was statistically significant (P<0.05). Cells were observed under an inverted microscope RMASMCs typical fusiform smooth muscle cell membrane integrity, smooth edges;its showed α-action positive expression by immunohistochemical staining.Conclusion: Acute phase separation and digestion method can successfully obtain larger quantities and higher quality RMASMCs.

Retinal microartery smooth muscle cells;Separation；Rats

國家自然科學基金資助項目(編號81400415)；江蘇省自然科學基金資助項目(編號SBK201222073)

南京醫科大學附屬無錫市人民醫院，無錫 214000；1眼科；3心內科；2蘇州市立醫院，蘇州 215000；#

，E-mail：pardl@126.com

本文2014-11-12收到，2014-12-01修回

R77 R322.9+1

A

1005-1740(2015)01-0023-03