2型糖尿病合并頸動脈粥樣硬化患者外周血單個核細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白mRNA的表達(dá)

謝海龍 李俊立 萬 靖 李承彬，*

2型糖尿病合并頸動脈粥樣硬化患者外周血單個核細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白mRNA的表達(dá)

謝海龍1李俊立2萬 靖2李承彬2，*

目的：分析2型糖尿病(T2DM)合并頸動脈粥樣硬化(CAS)患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)mRNA的表達(dá)及作用。方法：根據(jù)華盛頓大學(xué)CAS斑塊超聲分級標(biāo)準(zhǔn)將107例T2DM患者分為單純T2DM組(n=26)、T2DM輕度斑塊組(n=32)、T2DM中度斑塊組(n=38)和T2DM重度斑塊組(n=11)。另選非T2DM的CAS患者作為單純CAS組(n=35)，以及體檢健康者作為正常對照組(n=35)。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-FQ-PCR)技術(shù)檢測各組PBMCs中ASC mRNA表達(dá)水平。統(tǒng)計分析各組差異及ASC mRNA水平與CAS斑塊嚴(yán)重程度的關(guān)系。結(jié)果：各病例組ASC mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，T2DM合并CAS組ASC mRNA表達(dá)水平顯著高于單純CAS組(P<0.01)；ASC mRNA表達(dá)水平輕度斑塊組>中度斑塊組>重度斑塊組，即ASC mRNA表達(dá)水平與T2DM患者CAS斑塊程度呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.43，P<0.05)。結(jié)論：ASC mRNA表達(dá)增加可能是T2DM合并AS的發(fā)病因素和CAS斑塊活躍性的指征。

2型糖尿病；頸動脈粥樣硬化；外周血單個核細(xì)胞；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白

炎性小體激活是炎癥發(fā)生的重要機(jī)制，NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(Nod-like Receptor, Pyrin Domain Containing 3,NLRP3)作為膽固醇晶體、胰島淀粉樣多肽等內(nèi)源性信號受體[1]炎性小體，能啟動組織和器官的炎癥反應(yīng)[2],而凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein Containing a CARD,ASC)是NLRP3炎性小體的主要組成部分[3]，其mRNA高表達(dá)在慢性低度炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，如2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)等[4]，但ASC在T2DM合并AS中的表達(dá)水平和臨床作用少有研究報道。本文檢測分析T2DM合并頸動脈粥樣硬化(Carotid Atherosclerosis,CAS)患者外周血單個核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)中ASC mRNA表達(dá)水平與單純T2DM、單純CAS患者間的差異，探討ASC與T2DM合并AS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 對象與分組

2013-06-2013-12在本院就診糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)患者中符合中國2型糖尿病防治指南(2013)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]者107例,排除cryopyrin相關(guān)周期熱綜合征、痛風(fēng)、阿爾茨海默癥等炎性疾病。通過雙側(cè)頸動脈彩色超聲檢查并根據(jù)美國華盛頓大學(xué)CAS斑塊的超聲分級標(biāo)準(zhǔn)[6]分為單純T2DM組(n=26，0級，雙側(cè)頸動脈均無斑塊形成)和T2DM合并CAS組(n=81)，后者又分為三個亞組：即輕度斑塊組(n=32，Ⅰ級，單側(cè)頸動脈斑塊厚度≤2.0mm)；中度斑塊組(n=38，Ⅱ級，單側(cè)頸動脈斑塊厚度>2.0mm或雙側(cè)均有斑塊且其中至少一側(cè)斑塊厚度≤2.0mm)；重度斑塊組(n=11，Ⅲ級，雙側(cè)頸動脈斑塊厚度均>2.0 mm)。另選同期非T2DM CAS患者作為單純CAS組(n=35，患者CAS斑塊厚度均為Ⅲ級)。同期體檢健康者作為正常對照組(n=35)。各組性別、年齡分布無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，各疾病組血糖水平、高血壓患者比例等分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組一般臨床資料比較

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 儀器：多普勒彩色超聲診斷儀(IE33，荷蘭飛利浦公司)，低溫保溫箱(DW-40L188，中國青島海爾集團(tuán))，冷凍高速離心機(jī)(Auagra，美國貝克曼庫爾特公司)，漩渦混勻器(XW-80，中國上海醫(yī)大儀器廠)，微型離心機(jī)(MINI-6K，中國珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，原位PCR儀(GENIUS，英國Techne公司)，熒光定量PCR儀(ABI7300，美國ABI公司),自動生化分析儀(DXC800，美國BECKMAN公司)。

1.2.2 試劑：淋巴細(xì)胞分離液(批號20130613，北京Solarbio Science公司)，Trizon總RNA提取試劑盒(批號14105， 美國Life Technologies公司)，HIFI-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒及GoidStar TaqMan Mixture(with ROX)試劑盒(批號00021405和00051310，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，血糖檢測試劑盒(批號20130514，四川邁克公司)，β-actin和ASC引物及探針由美國life technologies公司合成。

1.3 檢測方法

所有疾病組患者均于初診時詢問、記錄年齡、測定血糖、血壓，行頸動脈彩色超聲檢查，并于確診病情且未予治療前檢測PBMCs中ASC mRNA表達(dá)水平；正常對照組于同期檢查體檢項目(不行頸動脈彩色超聲檢查)，確認(rèn)健康者再行檢測ASC mRNA。

1.3.1 血壓和空腹血糖(Fasting Blood-Glucose，F(xiàn)BG)監(jiān)測：采用水銀血壓計按臨床常規(guī)要求測量受試者右臂收縮壓和舒張壓，根據(jù)《中國高血壓防治指南》[7]建議的標(biāo)準(zhǔn)，≥140/90mmHg為高血壓。用分離膠采血管采集患者空腹(禁食8h)肘靜脈血5ml，靜置30min后，3 000r/min 離心10min分離血清，采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法測定FBG。

1.3.2 CAS斑塊的超聲檢測：囑受試者平臥，采用彩色超聲診斷儀，選擇10MHz線陣探頭掃描雙側(cè)頸總動脈、頸總動脈分叉及頸內(nèi)外動脈內(nèi)膜中層厚度(Intima Media Thickness,IMT)，測量動脈內(nèi)斑塊厚度，所有病例均選取最大厚度斑塊進(jìn)行比較分析。

1.3.3 ASC mRNA和β-actin檢測：方法如下。

(1)引物設(shè)計與合成：參照文獻(xiàn)[8]，在Gene Bank中搜索人類ASC基因序列和人類β-actin基因序列，使用primer express v2.0設(shè)計引物及探針，見表2。

表2 ASC和β-actin引物和探針序列

(2)總RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄：用EDTA抗凝管采集空腹肘靜脈血2ml，混勻后加入2ml生理鹽水，再混勻，加2ml淋巴細(xì)胞分離液，吸取PBMCs，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，用20μl DEPC水溶解備用。通過OD260/OD280鑒定RNA純度為1.8左右，瓊脂糖凝膠電泳鑒定確定為ASC mRNA和β-actin。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：配制反應(yīng)體總體積20μl，包括dNTP Mix 4μl、Primer Mix 2μl、5×RT Buffer 4μl、DTT 2μl、HIFI-MMLV 1μl、RNase-free water 2μl、模板5μl。反應(yīng)條件：42℃50 min、 85℃5min。產(chǎn)物于-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-FQ-PCR)：參照GoidStar TaqMan Mixture(with ROX)試劑盒說明書和有關(guān)文獻(xiàn)[9]，RT-FQ-PCR檢測ASC與β-actin時采用分管擴(kuò)增，反應(yīng)體積均為20μl，包括2×Glodstar Taqman Mixture 10μl、上下游引物及探針各1μl和逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μl，加RNase-Free water 至20μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性30s，56℃30s，62℃45s，10個循環(huán)后95℃變性15s，56℃退火15s，62℃延伸45s，30個循環(huán)。每個樣本均作三份，取均值采用雙德爾塔法計算目的基因的相對表達(dá)量，即相對表達(dá)量=2-△△Ct，其中△△Ct=(患者目的基因Ct-管家基因Ct)-(正常對照組目的基因Ct-管家基因Ct)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組ASC mRNA相對表達(dá)量

方差分析顯示，各組ASC mRNA相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.32，P<0.01)。三病例組均顯著高于正常對照組(P<0.05)，T2DM合并CAS組與單純T2DM組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.49,P>0.05)，但高于單純CAS組(t=4.63,P<0.01)；而單純T2DM組與單純CAS組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.19,P>0.05)。見表3。

表3 各組ASC mRNA相對表達(dá)量比較

注：與正常對照組比較，1)P<0.05；與單純CAS組比較,2)P<0.01

2.2 T2DM患者頸動脈斑塊厚度與ASC mRNA相對表達(dá)量的關(guān)系

輕度斑塊組ASC mRNA表達(dá)量顯著高于中度斑塊組(t=2.57,P<0.05)和重度斑塊組(t=3.32,P<0.01)，中度斑塊組與重度斑塊組雖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.41,P>0.05)，但有減少趨勢，即ASC mRNA相對表達(dá)量與斑塊厚度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.43，P<0.05)。見表4和圖1。

表4 T2DM合并不同程度頸動脈斑塊組ASC mRNA相對表達(dá)量比較

注：與T2DM重度斑塊組比較，1)P<0.01；與中度斑塊組比較，2)P<0.05

圖1 T2DM合并CAS患者ASC mRNA表達(dá)趨勢圖

3 討 論

T2DM和AS是兩種常見的代謝性疾病，均表現(xiàn)出持續(xù)低水平炎性反應(yīng)。ASC具有熱蛋白結(jié)合域和半胱天冬酶募集域(Caspase Recruitment Domain,CARD)兩個結(jié)構(gòu)域，可分別結(jié)合NLRP3和半胱天冬酶-1(Caspase-1)，形成炎性小體[10]。在T2DM和AS發(fā)生時，PBMCs中的單核巨噬細(xì)胞受膽固醇晶體、脂肪酸、胰島淀粉樣多肽等物質(zhì)激活NLRP3，使之募集ASC并與之結(jié)合，再激活A(yù)SC上的CARD，募集儲存狀態(tài)的Caspase-1形成活化NLRP3炎性小體，參與和傳導(dǎo)炎性反應(yīng)，維持炎癥進(jìn)展，成為T2DM和AS的重要機(jī)制[11]。

本研究證實(shí)，ASC mRNA在各疾病組中的表達(dá)量均顯著高于正常對照組(P<0.05)，這與有關(guān)文獻(xiàn)[3,12,13]的報道相一致。而T2DM合并CAS患者的ASC mRNA表達(dá)顯著高于單純CAS組，說明T2DM和CAS的發(fā)生、發(fā)展與ASC mRNA水平有關(guān)，其具體作用可能是機(jī)體中PBMCs受到胰島淀粉樣多肽或者膽固醇晶體等的刺激，使細(xì)胞內(nèi)ASC mRNA所在的NLRP3炎性小體活化，促使炎性因子成熟和釋放，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，繼而在炎癥的持續(xù)作用下使胰島β細(xì)胞和大動脈病變，導(dǎo)致T2DM和AS的發(fā)生發(fā)展。

本文對T2DM不同級別頸動脈斑塊患者ASC mRNA表達(dá)量的分析發(fā)現(xiàn)，在斑塊形成的不同時期，ASC mRNA表達(dá)量不同，其中輕度斑塊組表達(dá)量顯著高于中度和重度斑塊組(P<0.05或P<0.01)，即在CAS斑塊形成初期的ASC mRNA表達(dá)量最高，隨著CAS斑塊逐漸成熟，ASC mRNA表達(dá)漸趨降低。提示ASC mRNA高表達(dá)，即炎癥早期可能是啟動T2DM頸動脈斑塊形成的重要因素,而炎癥緩解或斑塊成熟又可使ASC mRNA表達(dá)下調(diào)。但其中的具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

總之,ASC mRNA高表達(dá)與T2DM合并CAS有關(guān)，PBMCs中ASC mRNA檢測或可作為監(jiān)測T2DM合并AS以及動脈斑塊活躍性監(jiān)測的參考指標(biāo)。

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本文第一作者簡介：

謝海龍(1982-)，男，漢族，碩士研究生，研究方向：心血管疾病的實(shí)驗室診斷

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CD144+/CD62E+內(nèi)皮微泡：一對監(jiān)測高血壓伴高血脂患者內(nèi)皮功能的新標(biāo)記

本刊編委，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所、國家衛(wèi)計委微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗室仉紅剛教授課題組于2014年在《International Journal of Cardiology》(IF=6.175)以“CD144+EMPs/CD62E+EMPs: A couple of new biomarkers to monitor endothelial function in hypertension with hyperlipidemia involved” 為題報道了對臨床高血壓伴高血脂患者進(jìn)行的內(nèi)皮細(xì)胞來源微泡研究結(jié)果，主要內(nèi)容如下：

1 研究對象和方法

1.1 研究對象：研究對象分為3組：高血壓伴高血脂組(n=22)、高血壓血脂正常組(n=13)和健康人對照組(n=24)。診斷和評判標(biāo)準(zhǔn)：血壓≥140/90mmHg為高血壓；總膽固醇≥5.18mmol/L或低密度脂蛋白≥3.37mmol/L或甘油三酯≥1.7mmol/L為高血脂；健康對照者為查體正常、血壓<140/90mmHg，且排除高血脂及慢性腎衰、肝病、血液性疾病、炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤等疾病史。

1.2 研究方法：以枸櫞酸鈉抗凝真空管采取3ml外周靜脈血液，以1 500g離心10min制備普通血漿，以13 000g離心10min制備去血小板血漿，采用流式細(xì)胞術(shù)(Accuri C6, Accuri Cytometers)分析CD144+和CD62E+內(nèi)皮細(xì)胞來源的內(nèi)皮微泡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SSPS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對3組微泡數(shù)量差異進(jìn)行比較，并以年齡、性別等為獨(dú)立變量建立多元線性回歸模型，分析其與CD144+和CD62E+內(nèi)皮微泡的關(guān)系。

2 主要結(jié)果

高血壓伴高血脂組的CD144+和CD62E+內(nèi)皮微泡數(shù)量顯著高于高血壓血脂正常組(P=0.033)及健康人對照組(P=0.006)；回歸分析未發(fā)現(xiàn)CD144+和CD62E+內(nèi)皮微泡數(shù)量與年齡和性別有明顯相關(guān)性。

3 主要創(chuàng)新結(jié)論和意義

本研究在國際上首次報道了CD144+和CD62E+內(nèi)皮細(xì)胞來源微泡是監(jiān)測高血壓伴高血脂的重要內(nèi)皮損傷相關(guān)指標(biāo)；認(rèn)為上述指標(biāo)能夠說明伴高血脂的高血壓患者其內(nèi)皮損傷更加嚴(yán)重。CD144+和CD62E+內(nèi)皮細(xì)胞來源微泡為伴高血脂的高血壓患者進(jìn)一步發(fā)展為冠心病提供了病理生理過程監(jiān)測和治療研究新的切入點(diǎn)。

該研究內(nèi)容為國家自然科學(xué)基金(No.11274046)和北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新基金(No.3332013021)資助項目；英文全文見International Journal of Cardiology,2014,175(1)：203.

Expression of Apoptosis-associated Speck-like Protein Containing a CARD mRNA in Type 2 Diabetes Mellitus and Carotid Atherosclerosis Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

XIE Hai-long1,LI Jun-li2,WAN Jing2,LI Cheng-bin2，*

1Yangtze University, Jingzhou 434020,China;2Department of Laboratory Medicine, Jingzhou City Central Hospital, Jingzhou 434020,China;*

Objective: To analysis expression and role of adaptor protein apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC)mRNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of type 2 diabetes mellitus (T2DM) merger with carotid atherosclerosis (CAS) patient. Method: 107 T2DM patients were enrolled, divided them into T2DM group (n=26),T2DM small plaque group (n=32),T2DM moderate plaque group (n=38), T2DM serious plaque group (n=11) according to atherosclerosis plaque ultrasonic classification constituded by Washington university.Another non T2DM CAS patients as CAS group (n=35), and healthy persons as normal control group (n=35).The ASC mRNA expression levels of PBMCs in each group was deteeted by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RT-FQ-PCR) technology.Statistical analysis of the differences between each group and relationship between ASC mRNA levels and the severity of CAS patches.Results: Expression level of ASC mRNA was significantly higher in the pathological group than normal control group (P<0.05), expression level of ASC mRNA was significantly higher in T2DM combined with CAS group than CAS group (P<0.01),ASC mRNA expression in small plaque group greater than moderate plaque group and severe plaque group,expression of ASC mRNA was negatively correlated with CAS plaque degree in T2DM patients(r=-0.43,P<0.05).Conclusion: Increased expression of ASC mRNA may be risk factor of T2DM combined with AS and CAS.

Type 2 diabetes mellitus;Carotid atherosclerosis；Peripheral blood mononuclear cells；Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD

1長江大學(xué)研究生院，湖北荊州 434020；2湖北省荊州市中心醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部，荊州 434020；*

，E-mail：jzlcb001@163.com

本文2014-11-19收到，2015-01-13修回

R587.1

A

1005-1740(2015)01-0037-05