湖北地區丙型肝炎患者HCV基因分型及HCV NS5B耐藥突變位點分析

盧恩昌 童永清 李 艷 吳 青

湖北地區丙型肝炎患者HCV基因分型及HCV NS5B耐藥突變位點分析

盧恩昌 童永清 李 艷*吳 青

目的：檢測湖北地區丙型肝炎(丙肝)患者丙肝病毒(HCV)基因分型及HCV NS5B基因耐藥突變位點的分布特征。方法：收集自2011-03-2014-05在本院確診的來自湖北地區的丙肝患者外周靜脈血標本273例，采用一代測序法檢測每例樣本的HCV和NS5B基因序列，將測得的序列與Blast進行在線比對后，統計分析HCV基因型和各亞型檢出率，以及HCV NS5B耐藥突變位點在HCV各基因亞型中的分布差異。結果：273例丙肝患者共檢出1、2、3、6四種基因型和1a、1b、2a、3a、3b、6a六種基因亞型，其中1b亞型檢出率較高，占76.19%(208/273)，其次是2a亞型，占15.02%(41/273)，其它各亞型檢出率均不超過4.40%，各亞型檢出率差異有統計學意義(P<0.05)。HCV NS5B基因以L159F突變率較高，占17.95%(42/234)，與其它位點的基因突變率差異有統計學意義(P<0.05)。同時各個位點的耐藥突變發生在2a亞型中的比例較高，達57.26%(134/234)，顯著高于其它亞型的耐藥突變(P<0.05)。結論：分析湖北地區丙肝患者HCV基因分型及HCV NS5B耐藥突變位點的分布特點，可為該地區丙肝患者的個體化治療提供指導依據。

丙肝病毒； 基因型； NS5B基因耐藥突變

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV )感染是導致慢性肝臟疾病的主要原因之一，全世界丙型肝炎(丙肝)患者超過1.8億人[1，2],中國HCV 的感染者約4000萬[1]。預計到2025年，與HCV感染相關的人類死亡率將會增至目前的3倍[1]，因而成為嚴重的公共衛生問題。近年來隨著直接抗病毒藥物(DDAS)的臨床應用， 抗HCV治療有了新的方案和進展，但HCV的耐藥性也由此產生，其原因可能由于HCV RNA依賴性RNA聚合酶(HCVRdRp)NS5B復制的精確性差，使HCV出現高度變異性和新的變種，部分變種還會在患者體內存活下來并對治療藥物產生耐藥性。所以，檢測分析NS5B RNA依耐性RNA聚合酶(NS5BRdRp)耐藥位點對丙肝的DDAS治療顯得非常重要。本文收集湖北地區丙肝患者樣本進行NS5B基因測序，分析其突變位點和突變率，為臨床抗HCV的耐藥性研究和個性化治療提供科學數據和支持。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集自2011-03—2014-05在本院首診的273例湖北地區漢族人群丙肝患者的相關資料，其中男113例，女160例，年齡18-75歲，生活環境和習慣均無異常。丙肝診斷參照2004年中華醫學會《丙型肝炎防治指南》診斷標準[3]，所有患者此次就診前均未進行過抗病毒治療。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑和儀器：核酸提取試劑盒(深圳匹基公司)，ABI系列PCR儀(美國)、ABI3130測序儀(美國)、PCR電泳儀(JY1600C，北京)、凝膠成像系統(BIO-PROFILE,法國)。

1.2.2 引物：采用Primer express 2.0軟件設計引物，由上海生工合成，上游引物：5’-ACG CTA CTG ACT A-3’，下游引物:5’-ACT GAT CTG CGT A-3’。

1.3 PCR方法

采集患者抗病毒治療前靜脈血5ml，按PCR常規方法進行樣本處理→試劑準備→核酸提取→逆轉錄→PCR核酸擴增→擴增產物凝膠電泳和產物膠回收。

1.4 基因測序、分型和耐藥位點比對

對273例膠回收PCR產物純化后進行基因測序，嚴格按儀器和試劑盒要求方法進行。將測序結果與http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpagex.cgi已公布的HCV基因亞型及耐藥位點進行比對，確定基因分型及耐藥突變位點。

1.4.1 HCV基因亞型：互聯網http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore已公布HCV基因亞型及編號(GI)有AF009606.1a(GI:2316097)、D90208.1b(GI:221610)、AB049088.1b(GI:11559442)、AF139594.1b(GI:23957856)、AF356827.1b(GI:15487693)、AF169004.2a(GI:6707283)、D00944.2a(GI:221650)、 AB047641.2a(GI:13122265)、AF046866.3a(GI:2895898)、 D17763.3a(GI:514395)、 D49374.3b(GI:676877)、Y12083.6a(GI:2326454)，共12個核苷酸序列及6種亞型，據此比對本文所測樣本的HCV亞型檢出率。

1.4.2 NS5B耐藥突變位點：對照Pub Med數據庫已經確認的30個耐藥突變位點(表1，1-5為主要耐藥位點，6-24為次要耐藥位點，25-30為少見耐藥位點),將本文273例樣本的測序結果與之在線比對，確定所測樣本NS5B的耐藥位點和突變情況。

表1 Pub Med數據庫NS5B 30個耐藥突變位點

1.5 統計學處理

應用SPSS 13.0統計學軟件。計數資料采用百分率表示，組間差異比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HCV基因型及亞型檢出率

經比對互聯網已公布的HCV 基因型(亞型)，本文273例患者檢出1、2、3、6 四種基因型和1a、1b、2a、3a、3b、6a 六種亞型，其中1a亞型 3例(1.10%)、1b亞型208例(76.19%)、 2a亞型41例(15.02%)、 3a亞型3例(1.10%)、3b亞型12例(4.40%)、6a亞型6 例(2.20%)； 1b亞型檢出率最高，與其它亞型檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=719.20，P<0.05)。

2.2 HCV NS5B耐藥突變位點檢出率及在HCV各基因亞型中的分布

對照表1所列30個NS5B耐藥突變位點，本文273例HCV樣本共檢出除S96Y(286-288)、L482I(1444-1446)和G486A(1456-1458)之外的27個耐藥位點共234處基因突變，其中以L159F突變率較高，占17.95%(42/234)，與其它位點的基因突變率比較，差異有統計學意義(χ2=272.32，P<0.05)。不同HCV基因亞型耐藥位點不同，基因變異數量也有差異，2a 亞型的耐藥位點和變異數量多于其它亞型，共有134處變異，占57.26%(134/234)，其它由高到低依次為1b亞型、 1a亞型、3b亞型、3a亞型。統計分析表明，六種HCV基因亞型的耐藥位點變異發生率差異有統計學意義(χ2=53.07，P<0.05)。主要、次要和少見耐藥位點在HCV各基因亞型中的分布情況見表2-表4。

3 討 論

目前至少有Okomoto、Kanazawa、Cha和Simmonds四類HCV基因型命名系統，以Simmonds比較通用，該系統將HCV遺傳變異性分為6種基因型，每種基因型又分為若干亞型[4]。分型方法也較多，最經典可靠的方法是核苷酸測序法。HCV基因分型對丙肝個體化治療至關重要[5]。達到持續病毒學應答(SVR)是治療HCV感染的目的，也是最重要的治療目標[6-8]。近年來抗HCV藥物研究取得了快速進展，特別是DAAS。DAAS根據HCV基因組序列及酶的作用方式確定作用靶點，主要靶點包括HCV NS2和NS3蛋白酶、NS4A、NA4B、NS5A和NS5B RNA依賴性RNA聚合酶,分別通過抑制病毒蛋白生理裂解、病毒復制復合體形成以及病毒復制來達到直接抗病毒作用[9]。HCV NS5B區是RNA依賴的RNA聚合酶編碼區，與HCV復制和致病性密切相關[10]。目前以HCV NS5BRdRp為特定作用靶點的藥物主要有兩種，一種是直接結合于NS5BRdRp催化活性位點的分子，這些分子可以競爭性結合核糖核苷三磷酸，通過阻斷RNA復制來終止RNA延長，從而終止病毒復制[12]，即核苷類聚合酶抑制劑。另一種是結合于變構位點的分子，與變構位點結合后產生變構效應，阻止RNA復制起始，終止病毒復制[11]，即非核苷類聚合酶抑制劑。這些基因位點中有部分位點與耐藥性顯著相關，并且容易發生變異，因此對丙肝相關疾病的個體化治療有重要意義。

表2 NS5B 4個主要耐藥突變位點在HCV各亞型中的分布

表3 NS5B 17個次要耐藥突變位點在HCV各亞型中的分布

表4 NS5B 6個少見耐藥突變位點在HCV各亞型中的分布

HCV基因型有明顯地域性,我國內地HCV基因型以1b、2a亞型為主,南方和北方存在明顯差別[12-14]。本文中的273例湖北地區丙肝患者以1b、2a 亞型為主，達90%，與我國北方地區流行情況相似；同時也有1a、3a、3b和6a亞型出現，也與蘇迎盈等[15]調查的華中地區以1b、2a 亞型為主的結果較一致。但本文樣本數量有限，結果有一定局限性，所測HCV NS5B核苷酸序列也并非NS5B完整核苷酸序列，在線比對結果可能與實際情況存在差異。不過，273例患者的HCV NS5B核苷酸序列中有很多耐藥突變位點，且不同基因亞型耐藥突變位點有較大差異，其中41例2a亞型中發現27個耐藥突變位點，耐藥位點總數達134處(57.26%)，6個少見突變位點也僅見于2a亞型，該結果與Gane等[16]的研究結果相似，這些結果對2a亞型丙肝患者的臨床抗病毒治療有重要意義，至少可提示臨床選擇不以這些突變位點為作用靶點的藥物以達到較好治療效果。而在我國流行較廣的1b亞型，本次檢測表明， 208例1b亞型樣本中有34處(14.53%)變異，耐藥突變位點包括L159F、C316Y及L419S。提示1b亞型丙肝患者的臨床DDAS治療可供選擇的方案較2a亞型丙肝患者廣泛，因此臨床療效也可能較高。

本文中其它HCV亞型大都存在著不同數量和不同位點的耐藥變異，情況較復雜，但由于本次檢測樣本較少，對于其耐藥突變位點的分布尚不能總結出可供參考的流行趨勢和特點，還有待大樣本、大范圍檢測論證。

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本文第一作者簡介：

盧恩昌(1985-)，男，漢族，碩士研究生，主要從事臨床微生物檢驗

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Genotyping and Analysis for Mutation Loci of Drug Resistance of HCV NS5B in Hubei Province

LU En-chang, TONG Yong-qing, LI Yan*, WU Qing

Department of Clinical Laboratory,Renming Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China;*Correspanding author

Objective: To detect genotypes of HCV and distribution characters of gene mutation loci of drug-resistant of HCV NS5B in hubei province. Method: Venous blood samples of 273 patients, since March 2011 to May 2014 diagnosed in our hospital from hubei province, were collected and detected for HCV and NS5B gene sequence by generation sequencing assay. Then we compared detected sequences with BLAST online, and analyzed statistically detection rates of each genotype and subtype of HCV and distribution differences of drug-resistant mutation loci of HCV NS5B.Results: There were 1,2,3 and 6 four kinds of genotypes and 1a,1b,2a,3a,3b and 6a six kinds of genetic subtypes in 273 cases. Of those, the detection rate of 1b was higher, accounting for 76.19%(208/273), followed by 2a subtype was 15.02%(41/273), the detection rate of other subtypes was not over 4.40%, and the difference of each subtype detection rates was statistically significant (χ2=719.20,P<0.05). The gene mutation rate of L159F site in HCV NS5B was higher, accounting for 17.95% (42/234), compared with mutation rates of other sites, the difference was statistically significant (χ2=272.32,P<0.05). While all the sites of gene mutations in HCV 2a subtype was in a higher proportion up to 57.26% (134/234), significantly higher than mutation rates of other subtypes(χ2=53.07,P<0.05).Conclusion: Analysis of genotypes of HCV and distribution characters of drug-resistant mutation loci of HCV NS5B in hubei province could provide basis for individualized treatment in the area.

Hepatitis C Virus;Genetypes;NS5B drug-resistance mutation

武漢大學人民醫院檢驗科， 武漢 430060；*

，E-mail: yanlitf1120@163.com

本文2014-07-11收到，2014-11-24修回

R446.9

A

1005-1740(2015)01-0042-04