長(zhǎng)江刀鱭體內(nèi)菌群PCR-DGGE指紋圖譜及多樣性比較分析

聶志娟徐鋼春杜富寬沈芬華黃敏康顧若波

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無(wú)錫 214128；2. 江蘇省宜興市新莊街道農(nóng)業(yè)服務(wù)中心, 宜興 214266； 3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)漁業(yè)學(xué)院, 無(wú)錫 214128)

長(zhǎng)江刀鱭體內(nèi)菌群PCR-DGGE指紋圖譜及多樣性比較分析

聶志娟1徐鋼春1杜富寬1沈芬華2黃敏康3顧若波1

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無(wú)錫 214128；2. 江蘇省宜興市新莊街道農(nóng)業(yè)服務(wù)中心, 宜興 214266； 3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)漁業(yè)學(xué)院, 無(wú)錫 214128)

以長(zhǎng)江刀鱭(Coilia nasus)洄游前幼魚(yú)和洄游后成魚(yú)為對(duì)象, 通過(guò) PCR-DGGE 指紋技術(shù)探討長(zhǎng)江刀鱭菌群多樣性及受洄游路徑周圍環(huán)境影響之后的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示, PCR-DGGE 指紋譜帶豐富, 共顯示出 70條可鑒別條帶, 其中長(zhǎng)江水體譜帶數(shù)(28)高于洄游后刀鱭鰓(26)、胃(26)、腸道壁(20)、腸道內(nèi)容物(21)和洄游前刀鱭鰓(21)、胃(20)、腸道壁(11)、腸道內(nèi)容物(13), 洄游后刀鱭成魚(yú)體內(nèi)各對(duì)應(yīng)部位菌群數(shù)顯著高于洄游前刀鱭幼魚(yú)。UPGMA 聚類和PCA結(jié)果顯示不同樣品之間差異顯著, 雖長(zhǎng)江水體與洄游后刀鱭鰓、胃及腸道內(nèi)容物樣品在聚類圖上聚為一簇, 但其菌群結(jié)構(gòu)的相似度較低, 分別為43%、35%和28%。成功克隆測(cè)序其中 43條條帶, 主要包含 α-變形菌(25.6%)、β-變形菌(7%)、γ-變形菌(16.3%)、放線菌(25.6%)、厚菌門(mén)(9.3%)、擬桿菌(7%)、柔膜菌門(mén)(4.6%)、綠彎菌(2.3%)和未定義菌(2.3%)。以上結(jié)果表明長(zhǎng)江刀鱭體內(nèi)不同部位及其在洄游前后不同階段, 菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異, 并受環(huán)境和宿主雙層因素影響。

PCR-DGGE； 長(zhǎng)江刀鱭； 洄游； 香農(nóng)指數(shù)； 細(xì)菌菌落

微生物個(gè)體微小, 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 但數(shù)量龐大, 種類豐富在生命活動(dòng)中扮演重要的角色, 對(duì)宿主生物體健康、營(yíng)養(yǎng)和免疫等具有重要作用。關(guān)于魚(yú)類微生物研究, 人類早在 1953 年就有研究報(bào)道[1], 隨后有關(guān)水產(chǎn)微生物生態(tài)生理研究報(bào)道越來(lái)越多, 研究技術(shù)愈來(lái)愈成熟。不僅如此, 基于16S rDNA的PCR-DGGE基因指紋技術(shù)是一種不依賴分離純化培養(yǎng)且菌群結(jié)構(gòu)原位探究的有效方法, 目前已經(jīng)成為微生物群落研究強(qiáng)有力工具之一[2], 可以較快速揭示某一環(huán)境樣品中的微生物結(jié)構(gòu)組成和動(dòng)態(tài)變化[3]。數(shù)據(jù)表明, 該技術(shù)可鑒定出許多無(wú)法培養(yǎng)的菌種[4],廣泛運(yùn)用于土壤[5]、海洋湖泊[6]、食品微生物[7]及動(dòng)物消化道[8]等不同生態(tài)環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)調(diào)查和種群動(dòng)態(tài)變化分析。事實(shí)證明, 由于食性、基因等因素的影響, 不同種類魚(yú)的腸道細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)也不盡相同。Ward等[9]在研究得出雜食性的南極巖斑鱈魚(yú)(Notothenia coriiceps)比肉食性的頭帶冰魚(yú)(Chaenocephalus aceratus)腸道微生物豐富, 也已有研究報(bào)道指出不同生長(zhǎng)環(huán)境下魚(yú)類的腸道細(xì)菌群落有明顯的差異[10]。盡管如此, 關(guān)于洄游性魚(yú)在不同洄游路徑階段體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的報(bào)道較少。

刀鱭(Coilia nasus) 隸屬鯡形目(Clupeiformes)鳀科(Engraulidae) 鱭屬(Coilia), 又名長(zhǎng)頜鱭, 俗稱刀鱭[11]。刀鱭主要分布在中國(guó)、日本和朝鮮半島, 包括洄游、淡水定居及海水定居 3種生態(tài)類型, 其中洄游生態(tài)型[12]刀鱭生活史中經(jīng)歷兩種不同的水域環(huán)境, 春季性成熟后從近海口溯江產(chǎn)卵繁殖, 秋季幼魚(yú)沿水返海肥育。其肉質(zhì)鮮美, 營(yíng)養(yǎng)豐富, 與河豚(Tetraodontidae fasciatus)、鰣(Tenualosa reevesii)并稱為中國(guó)長(zhǎng)江三鮮, 為名特優(yōu)珍稀魚(yú)類。

本試驗(yàn)通過(guò) PCR-DGGE 技術(shù)檢測(cè)刀鱭微生物區(qū)系組成, 對(duì)比探究洄游前后刀鱭菌群結(jié)構(gòu)差異及多樣性分析, 探討長(zhǎng)江刀鱭菌群受洄游路徑周圍環(huán)境影響之后的穩(wěn)定性, 將有助于刀鱭洄游路徑中菌群變化特征及長(zhǎng)江刀鱭腸道固有菌群的確定, 為腸道細(xì)菌的功能定位提供基礎(chǔ)依據(jù)及刀鱭養(yǎng)殖專用益生菌的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實(shí)驗(yàn)樣品魚(yú)采集位于長(zhǎng)江靖江段, 采集時(shí)間為: 2012年9月隨機(jī)抽取10尾新鮮幼魚(yú)(洄游前刀鱭), 體重為(4.94±2.57) g, 體長(zhǎng)(106.2±14.4) mm；2014年 4月采集 10尾長(zhǎng)江刀鱭成魚(yú)(洄游后刀鱭),體重為(114.51±27.91) g, 體長(zhǎng)(280.1±63.2) mm, 同時(shí)在刀鱭捕撈處采集水深1.5 m左右水樣1 L, 放置于冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 樣品處理

在超凈工作臺(tái)上處理實(shí)驗(yàn)魚(yú), 先用75 %酒精噴灑體表、無(wú)菌的解剖剪刀分別取出長(zhǎng)江刀鱭鰓、胃、腸及腸內(nèi)容物, 將同一批次的采集樣品的相同組織合并于–30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

水樣處理在超凈工作臺(tái)上操作, 用0.22 μm 的無(wú)菌濾膜和真空抽濾裝置過(guò)濾水樣, 在無(wú)菌條件下將濾膜上的過(guò)濾物用無(wú)菌水在無(wú)菌培養(yǎng)皿中沖洗下來(lái), 在 12000 r/min離心 5min, 收集沉淀物保存于–30℃。

1.3 總DNA提取

所有樣品在提取 DNA 之前需完全解凍。DNA提取參照Yu等[13]的方法, 并結(jié)合傳統(tǒng)的CTAB法稍作修改。稱取約 0.25—0.5 g樣品到滅菌的2 mL離心管, 加入1 mL 細(xì)胞裂解液(1.4 mol/L NaCl, 2% CTAB, 100 nmol/L Tric-HCl, 50 mmol/L EDTA), 20 μL 20 mg/mL蛋白酶k, 20 μL 20 mg/mL 溶菌酶, 漩渦震蕩5min； 37℃ 250 r/min搖床振動(dòng) 1h, 加入100 μL的 20% SDS, 漩渦混勻 3min, 65℃水浴 40min, 13000 r/min 4℃離心5min, 將上清吸入2 mL離心管中； 加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇抽提, 12000 r/min離心 5min, 取上清； 加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇重復(fù)抽提純化一次； 取上清液加入等體積氯仿∶異戊醇去酚純化； 上清液吸入至新的無(wú)菌離心管加入0.6倍體積的異丙醇沉淀, –20℃, 放置 30min；12000 r/min離心10min, 棄上清； 用70%預(yù)冷乙醇洗滌沉淀, 無(wú)菌風(fēng)吹干, 加適量無(wú)菌水溶解 DNA。樣品各取 5 μL DNA, 0.7 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 PCR-DGGE分析

PCR具體擴(kuò)增引物和條件參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。將具有清晰條帶PCR的產(chǎn)物進(jìn)行變形梯度凝膠電泳(DGGE)分析。凝膠濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠[化學(xué)變性劑為100%尿素7 mol/L和40%(v/v)的丙烯酰胺]；變形梯度為35%—55%。電泳條件: 60℃, 在1×TAE緩沖液中150 V下電泳10h。銀染步驟參考郁二蒙等[15]的方法進(jìn)行。在銀染后, 在Vilber凝膠成像掃描系統(tǒng)中照像, 并用BIO-RAD Quantity One 軟件對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行分析, 通過(guò)Biodap軟件對(duì)樣品泳道灰度值進(jìn)行分析計(jì)算得出一些比較不同樣品微生物多樣性的基本指標(biāo)。電泳條帶的數(shù)量可以代表樣品群落的豐富度指數(shù)； 香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon diversity index)反應(yīng)群落多樣性, Evenness 代表樣品群落的均勻度； Berger-Parker Index 用來(lái)表示優(yōu)勢(shì)度[16]。

1.5 DGGE圖譜中部分優(yōu)勢(shì)條帶的回收與測(cè)序分析

用滅菌的手術(shù)刀切割待回收DGGE條帶, 加入30 μL無(wú)菌水4℃靜置過(guò)夜。以DNA浸出液為模板, 338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系和程序參考文獻(xiàn)[17]。將有擴(kuò)增結(jié)果為200 bp左右的PCR產(chǎn)物進(jìn)行 TA克隆, 并挑選陽(yáng)性克隆子寄至上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定, 測(cè)序結(jié)果去載體并NCBI進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 DGGE指紋圖譜建立及分析

采用 PCR-DGGE 技術(shù)分析刀鱭洄游前后體內(nèi)微生物群落多樣性, 結(jié)果顯示(圖 1), 指紋圖譜上共產(chǎn)生了70條可鑒別的條帶, 每一條泳道代表一種來(lái)源樣品的 DGGE 指紋圖譜, 不同位置的條帶代表不同的菌群, 長(zhǎng)江水體、鰓(洄游后)、鰓(洄游前)、胃(洄游后)、胃(洄游前)、腸道壁(洄游后)、腸道壁(洄游前)、腸道內(nèi)容物(洄游后)、腸道內(nèi)容物(洄游前)分別具有可鑒別的條帶為28、26、21、26、20、20、11、21和13條, 其中, 長(zhǎng)江水體的條帶數(shù)量為最多。條帶的數(shù)量的多少反應(yīng)了該樣品細(xì)菌的多樣性程度,充分顯示了刀鱭及其生存環(huán)境樣品的菌群多樣性。各泳道含有數(shù)目、遷移率及信號(hào)強(qiáng)度各異的條帶,不同樣品的菌落帶型有明顯差別, 其中數(shù)量、位置和亮度的差異表明長(zhǎng)江刀鱭洄游路徑體內(nèi)菌群組成是不同的, 反映了由江入海的環(huán)境差異影響長(zhǎng)江刀鱭體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)組成。指紋圖譜帶型的差別可以很好地反映出長(zhǎng)江洄游細(xì)菌種群組成的差異與相同之處。指紋圖譜UPGMA聚類分析圖(圖2)。長(zhǎng)江水體與洄游后刀鱭鰓、胃及腸道內(nèi)容物樣品在聚類圖上聚為一簇, 菌群結(jié)構(gòu)的相似度為分別 43%、35%和28%。表明同一水體環(huán)境內(nèi)刀鱭體內(nèi)物質(zhì)交替頻繁樣品間菌落結(jié)構(gòu)具有一定的相關(guān)性, 由于此類樣品在空間位置上緊密相連、相互影響所致。

圖1 菌群 16S rDNA變性梯度凝膠電泳(DGGE) 指紋圖譜及模式圖(1—70: 條帶數(shù))Fig. 1 The DGGE fingerprint profiles on 16S ribosomal DNA (rDNA) of the bacterial communities

圖2 菌群的UPMGA 聚類分析Fig. 2 The UPMGA clustering analysis of the bacterial communities

根據(jù)DGGE圖譜各泳道的灰度值計(jì)算基本參數(shù)進(jìn)行多樣性比較分析(表 1), 長(zhǎng)江水體豐富度(條帶數(shù))27及香農(nóng)指數(shù)為3.23, 明顯高于洄游前后長(zhǎng)江刀鱭體內(nèi)菌群種類, 同時(shí)刀鱭鰓(洄游后)、鰓(洄游前)、胃(洄游后)、胃(洄游前)、腸道壁(洄游后)、腸道壁(洄游前)、腸道內(nèi)容物(洄游后)、腸道內(nèi)容物(洄游前)香農(nóng)多樣性指數(shù)分別為2.96、2.83、3.10、2.92、2.85、2.17、2.87和2.47, 可以代表各個(gè)樣品細(xì)菌多樣性。從均勻度指數(shù)比較, 樣品之間均勻度無(wú)較大差別,洄游前長(zhǎng)江刀鱭腸道壁均勻度最差(0.91), 而菌落優(yōu)勢(shì)度指數(shù)較大(0.164)； 長(zhǎng)江水體、洄游后刀鱭鰓、胃、腸道壁及腸道內(nèi)容物均勻度最高(0.97), 反映優(yōu)勢(shì)度較小, 與優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(都小于 0.097)結(jié)果顯示一致。PCA結(jié)果顯示(圖 3): 不同樣品之間距離較遠(yuǎn),存在明顯差異； 第一軸貢獻(xiàn)率 23.2%, 第二軸貢獻(xiàn)率17.9%, 在軸一上清晰顯示不同樣品之間差異。

表1 DGGE指紋圖譜微生物多樣性指數(shù)Tab. 1 The microbial diversity indices calculated from the DGGE banding patterns

圖3 DGGE指紋圖譜PCAFig. 3 PCA of DGGE profiles

2.2 部分優(yōu)勢(shì)條帶的序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

對(duì)DGGE指紋圖譜中70條帶全部切膠回收, 其中 43條條帶被成功克隆測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果比對(duì)制表分析(表2)。在43個(gè)測(cè)序結(jié)果中, 與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中微生物的同源性為 94%以上, 67%菌同源性達(dá)到了100%, 主要包含α-變形菌(25.6%)、β-變形菌(7%)、γ-變形菌(16.3%)、放線菌(25.6%)、厚菌門(mén)(9.3%)、擬桿菌(7%)、柔膜菌門(mén)(4.6%)、綠彎菌(2.3%)和未定義菌(2.3%)。養(yǎng)殖水體菌群最豐富, 共顯示28條帶, 不同條帶濃度及顯示的灰度各異, 條帶band2、12、20、24、25、28、31、37、46、55和67為養(yǎng)殖水體的相對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群, 成功測(cè)序結(jié)果中包含厚壁菌、柔膜菌門(mén)、α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌和放線菌。洄游前后刀鱭鰓和胃菌群種類較豐富、條帶數(shù) 20以上,水體與洄游前后刀鱭鰓相似度相對(duì)較高, band26、28、41、42、48、49、51和59為其共有帶菌, 為變形菌和放線菌, 序列比對(duì)相似度為 99%以上； band33檢測(cè)為唯一綠彎菌, 存在于長(zhǎng)江水體、洄游前刀鱭鰓胃部及洄游后刀鱭胃腸道壁樣品中。

表2 DGGE譜帶回收獲得的16S rDNA序列分析比對(duì)結(jié)果Tab. 2 Sequence similarities to closest relatives of 16S rDNA recovered from the DGGE gel

3 討論

目前對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物菌群的研究較多, 較早的研究采用傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法, 16S rDNA 基因文庫(kù)構(gòu)建法分析群落結(jié)構(gòu)組成[18,19], 但因在自然條件下多為不可培育菌及克隆法費(fèi)時(shí)費(fèi)力不直觀, 之后則發(fā)展出如PCR-DGGE、T-RFLP、PCR-SSCP等多種高效的監(jiān)視微生物群落動(dòng)態(tài)的分子生物學(xué)方法[20]。DGGE技術(shù)依據(jù)16S rDNA可變區(qū)核酸物質(zhì)的高分辨分離提供微生物群落多樣性的指紋圖譜被廣泛應(yīng)用, 但DGGE和其他方法一樣也有它的缺點(diǎn)。DGGE通常只能檢測(cè)到群落中含量超過(guò)1%優(yōu)勢(shì)菌種的16S rDNA 片段[21], 較多研究結(jié)果揭示某些單一菌種16S rDNA存在多拷貝或者異源雙鏈, 序列相同但因堿基構(gòu)象不同, 顯示在圖譜的不同位置[22—24], 本研究結(jié)果也再次佐證這一結(jié)論, 如圖譜中條帶47、48、54和57序列相同； 條帶8和65序列一致, 與Clostridium aurantibutyricum (NR_044841.2) 相似度為100%。盡管DGGE 技術(shù)與理論預(yù)期存在一定的差距, 但倪加加等[25]對(duì) DGGE凝膠條帶內(nèi) DNA回收測(cè)序評(píng)估DGGE 可靠性得出DGGE 技術(shù)基本能夠反映微生物群落的多樣性。

本文采用香濃多樣性指數(shù)反映刀鱭菌群多樣性,由表 1 可以看出洄游前后刀鱭各部位菌群豐富,多樣性指數(shù)高 (2.17—3.17), 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鋸緣青蟹(Scylla serrata)(0.897—1.309)[26]； 此外, 多樣性指數(shù)差異明顯, 洄游后刀鱭鰓、胃、腸道壁和腸道內(nèi)容物比洄游前刀鱭對(duì)應(yīng)部位香濃多樣性指數(shù)值都高,及可能由洄游后刀鱭經(jīng)歷海洋生境生長(zhǎng)、生存環(huán)境更為復(fù)雜狀況所導(dǎo)致的。DGGE圖譜聚類分析得出,雖長(zhǎng)江水體與洄游后刀鱭鰓、胃及腸道內(nèi)容物樣品在聚類圖上聚為一簇, 但其菌群結(jié)構(gòu)的相似度較低,分別為 43%、35%和 28%； 洄游型刀鱭不同時(shí)期的相似性不高, 菌群結(jié)構(gòu)差異明顯, 同時(shí)洄游前刀鱭體內(nèi)各部位樣品之間菌群結(jié)構(gòu)相似度更低(＜29%),充分顯示宿主本身對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的分布起到?jīng)Q定性作用。Li等[27]探究四種同一養(yǎng)殖條件下的白鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Hypophthalmichthys nobilis)、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)和團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)的仔魚(yú)腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu), 證明 4種仔魚(yú)宿主顯著地影響著其腸道菌群結(jié)構(gòu)。不同生長(zhǎng)時(shí)期(洄游前和洄游后), 刀鱭鰓部菌群結(jié)構(gòu)相似度為 33.8%, 而同一養(yǎng)殖條件下三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)與鋸緣青蟹[28]鰓組織內(nèi)黏附菌群結(jié)構(gòu)相似度為 75%, 相似度差異如此明顯, 直接顯示環(huán)境變更也將較大程度影響菌群結(jié)構(gòu)。刀鱭從開(kāi)口攝食, 體內(nèi)不同部位就開(kāi)始黏附并寄生菌群, 逐漸形成特有的優(yōu)勢(shì)菌種, 從而造成了與外部環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)的差異, 但同時(shí)又受制于外部環(huán)境的影響。

DGGE圖譜序列測(cè)定結(jié)果顯示, 刀鱭菌群鑒定主要分類于變形菌、放線菌、厚壁菌、擬桿菌、柔膜菌、綠彎菌和少量未定義菌種, 菌群類別豐富, 其中變形菌類群又包含 α、β、γ亞群, 占測(cè)定菌群48.9%, 為刀鱭的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。Kim等[29]分析虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腸道菌群, 發(fā)現(xiàn)大于 70%的細(xì)菌屬于變形菌門(mén)； 也有許多研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌多為正常健康水產(chǎn)動(dòng)物中普遍存在的菌群類別, 發(fā)揮著輔助消化, 增強(qiáng)免疫, 拮抗外來(lái)病原菌群提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等功效[30], 其中 Sugita等[31]研究得出, 專性厭氧菌如擬桿菌(Bacteroides)、梭菌屬(Clostridium)是維生素B12的主要產(chǎn)生菌； Rawls等[32]發(fā)現(xiàn), 斑馬魚(yú)(Barchydanio rerio var)消化道內(nèi)菌群能夠調(diào)控腸道 212個(gè)基因, 其中部分菌群能夠刺激上皮細(xì)胞增殖和先天性免疫應(yīng)答與促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝。魚(yú)類寄生菌群作為微生物的一個(gè)資源庫(kù), 富含許多不同特性的功能細(xì)菌, 亟需深入研究及開(kāi)發(fā)。本研究中菌群指紋圖譜顯示豐富的菌群結(jié)構(gòu), 但較多優(yōu)勢(shì)菌群未成功鑒定, 需結(jié)合其他研究方法進(jìn)一步深入探究刀鱭優(yōu)勢(shì)菌群的功能特性。

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PCR-DGGE FINGERPRINTING AND DIVERSITY ANALYSIS OF THE PREDOMINANT BACTERIAL COMMUNITY IN COILIA NASUS

NIE Zhi-Juan1, XU Gang-Chun1, DU Fu-Kuan1, SHENG Fen-Hua2, HUANG Min-Kang3and GU Ruo-Bo1
(1. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214128, China； 2. Xinzhuang street agricultural service center, Yixing 214266； 3. College of Fisheries, Nanjing Agriculture University, Wuxi 214128, China)

In this study we investigated the diversity and stability of the bacterial community structure in the juvenile (before the migration) and adult (after the migration) Coilia nasus using PCR-DGGE. The DGGE fingerprint bands were abundant and there were 70 detectable bands with different signal intensities. The number of bands in the water (28) was higher than that in the gill, the stomach, the intestinal wall, and the intestinal contents of Coilia nasus before and after the migration. And the numbers of the bands in the tested organs in adult Coilia nasus were higher than those in juvenile Coilia nasus. The UPGMA clustering and PCA analysis of the DGGE fingerprint showed significant differences between samples. Between the water sample and the post-migration Coilia nasus, the similarities of the bacteria structures in the fish gill, the stomach and the intestinal contents were only 43%, 35% and 28% respectively. Forty-three DGGE bands were successfully cloned including α-Proteobacteria (25.6%), β-Proteobacteria (7%), γ-Proteobacteria (16.3%), Actinobacteria (25.6%), Firmicutes (9.3%), Bacteroidetes (7%), Tenericutes (4.6%), Chloroflexi (2.3%), and some unclassified bacteria (2.3%). These results revealed that the bacterial community varied significantly at different migration stages, and in different bacterial parasitic parts of Coilia nasus. Therefore the external environment and the host should be the main factors affecting the composition of a bacterial community.

PCR-DGGE； Coilia nasus； Migration； Shannon index； Bacterial community

Q938.8

A

1000-3207(2015)05-1019-08

10.7541/2015.133

2014-10-17；

2015-03-26

公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(No.201203065)； 國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012BAD26B05)； 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(No.2013JBFT04)； 農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題資助

聶志娟(1985—), 女, 江西新干人； 助理研究員； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)微生物學(xué)。E-mail: niezj@ffrc.cn

顧若波, E-mail: gurb@ffrc.cn