西妥昔單抗聯合紫杉醇對人鼻咽癌CNE-1細胞活力的影響及其可能的分子機制探討

王文慧，王曉玲

(蘭州軍區臨潼療養院藥械科，西安 710600)

?

西妥昔單抗聯合紫杉醇對人鼻咽癌CNE-1細胞活力的影響及其可能的分子機制探討

王文慧※，王曉玲

(蘭州軍區臨潼療養院藥械科，西安 710600)

摘要：目的研究西妥昔單抗聯合紫杉醇對人鼻咽癌CNE-1細胞活力的影響及其可能分子機制。方法培養人鼻咽癌CNE-1細胞株，分為空白對照組、西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組，通過噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力、劃痕試驗檢測細胞遷移能力、Western-blot法檢測基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、表皮生長因子受體(EGFR)的mRNA和蛋白水平。結果①聯合用藥組的MTT值(36±7)和遷移能力相對值(21±6)，低于西妥昔單組的MTT值(62±10)、遷移能力相對值(55±10)和紫杉醇組的MTT值(59±11)、遷移能力相對值(57±10)，差異有統計學意義(P<0.05)。②聯合用藥組EFGR、MMP-2的mRNA含量分別為(50±14)、(45±11)，低于西妥昔單組的(67±18)、(69±16)和紫杉醇組的(60±17)、(64±19)，差異均有統計學意義(P<0.05)；聯合用藥組的EFGR、MMP-2蛋白含量分別為(43±13)、(36±8)，低于西妥昔單組的(69±15)、(64±10)和紫杉醇組(56±14)、(63±9)，差異均有統計學意義(均P<0.05)。結論西妥昔單抗聯合紫杉醇能夠抑制人鼻咽癌CNE-1細胞的增殖和遷移能力，這一作用可能是通過抑制EFGR、MMP-2的表達來實現的。

關鍵詞：鼻咽癌；西妥昔單抗；紫杉醇；增殖；遷移

鼻咽癌是一類具有高度惡性生物學行為的上皮源性腫瘤，近年來發病率不斷升高。放射治療是該病的主要治療手段，可以取得較高的局部控制率，但由于鼻咽癌細胞生長迅速及高轉移特性，仍有較高的局部復發和(或)遠處轉移率?；诒茄拾┘毎鲋?、遷移等惡性生物學行為，探尋能夠抑制該生物學行為的治療方式具有積極的臨床應用前景[1-2]。本研究通過培養人鼻咽癌CNE-1細胞株來分析西妥昔單抗聯合紫杉醇對其增殖、遷移能力影響及其可能的分子機制，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料人鼻咽癌CNE-1細胞株購買于中科院細胞庫；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養基和胎牛血清均購買于美國Sigma公司；抗體購買于美國Abcam公司；離心管和細胞培養板購買于美國Corning公司；西妥昔單抗、紫杉醇等藥品購買于美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細胞復蘇和培養方法將細胞從液氮罐中取出后迅速置于37 ℃水浴鍋中，并將細胞懸液移入15 mL離心管中，1000×g離心10 min，棄上清后用5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸，移入培養瓶中在37 ℃、5% CO2孵箱中培養。當細胞鋪滿70%～80%且處于對數生長期時，用胰酶常規消化、傳代并終于12孔板。

1.2.2細胞處理方法當12孔板內細胞鋪滿70%～80%后，將含血清的DMEM更換為不含血清的DMEM培養24 h，而后分別用不含藥物的DMEM(空白對照組)、50 μg/L 西妥昔單抗(西妥昔單抗組)、100 μg/L紫杉醇(紫杉醇組)、50 μg/L 西妥昔單抗聯合100 μg/L紫杉醇(聯合用藥組)處理。24 h后進行相應檢測。

1.2.3噻唑藍法藥物處理24 h后，小心吸去上清，加入160 μL DMEM培養基、40 μL 0.5%噻唑藍(MTT)溶液，孵箱中繼續培養4 h。而后吸盡上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜，置于搖床上低速振蕩10 min，而后在酶標測儀上檢測490 nm 處的吸光值，并以此直接反映活細胞數目。令對照組細胞的增殖能力為100，求出西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組細胞增殖能力的相對值。

1.2.4劃痕試驗藥物處理同時用無菌的200 μL槍頭在細胞孔中央做一劃痕，于鏡下觀察并拍照記錄(0 h)；在孵箱中繼續培養24 h后于鏡下觀察并拍照記錄(24 h)。用Image J分析圖像劃痕面積A0、A24，計算(A0-A24)/A0并以此來反應細胞的遷移能力。令對照組細胞的遷移能力為100，求出西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組細胞遷移能力的相對值。

1.2.5實時定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)采用Trizol法抽細胞中的總mRNA、并反轉錄合成cDNA第一鏈，采用熒光定量PCR進行擴增，擴增條件：95 ℃、15 s，特異性退火溫度、30 s，72 ℃、30 s，40個循環。分別擴增同一樣本的目的基因和看家基因，利用其ΔCt值進行相對定量。即用同組中每個樣本目的基因的Ct值減去的β-actin 的Ct值(ΔCt)，再用處理組的ΔCt減去對照組的Δct(ΔΔCt)，代入公式2-ΔΔCt計算即得到處理組相對對照組mRNA含量的相對值，并以空白對照組的目的基因mRNA含量為100、求出西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組目的基因mRNA含量。

1.2.6Western-blot提取細胞蛋白后于4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清進行電泳。按配方配置4%的濃縮膠和10%的分離膠，點樣后進行100 V、20 min，120 V、90 min的垂直電泳和100 V、90 min的電轉膜。完成后取出硝酸纖維素膜用5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗滌5 min×3遍，根據分子量裁剪NC膜并分別加入1∶1000的表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、actin第一抗體，4 ℃搖床孵育過夜。第2天取出NC膜，TBST洗滌5 min×3遍，加入1∶1000的辣根過氧化物酶標記的第二抗體、室溫孵育2 h后，用TBST洗滌10 min×3遍。最后進行顯影。計算蛋白條帶的灰度值，以目的基因灰度值/actin灰度值作為蛋白含量，令對照組的目的基因蛋白含量的均值為100，計算西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組的蛋白含量。

2結果

2.1細胞增殖能力空白對照組、西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組的MTT值分別為(100±18)、(62±10)、(59±11)、(36±7)，4組間比較差異有統計學意義(F=17.644,P<0.05)，其中西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組的MTT值均低于空白對照組，差異有統計學意義(t=7.854，8.485，16.394，均P<0.05)，且聯合用藥組的MTT值低于西妥昔單抗組和紫杉醇組(t=8.979，7.668，均P<0.05)。見圖1。

a與空白對照組比較，P<0.05；b與西妥昔單抗組和紫杉醇組比較，P<0.05圖1　不同處理組CNE-1細胞的MTT檢測結果

2.2細胞遷移能力4組細胞0 h和24 h時的劃痕情況見圖2(上)，空白對照組、西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組的遷移能力相對值分別為(100±20)、(55±10)、(57±10)、(21±6)，4組間比較差異有統計學意義(F=21.895,P<0.05),其中西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組的遷移能力相對值均低于空白對照組(t=9.942，9.483，17.686，均P<0.05)，且聯合用藥組的遷移能力相對值低于西妥昔單抗組和紫杉醇組(t=12.845，12.029，均P<0.05)。見圖2。

2.3影響細胞增殖、遷移能力可能的分子機制西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組EGFR的mRNA和蛋白含量均低于空白對照組(t=6.987，7.283，10.485，均P<0.05；t=6.203，8.985，11.985，均P<0.05)，西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯合用藥組MMP-2的mRNA和蛋白含量均低于空白對照組(t=6.183、7.049、11.094，均P<0.05；t=7.049、7.193、14.495，均P<0.05)，且聯合用藥組EGFR的mRNA和蛋白含量低于西妥昔單抗組和紫杉醇組(t=5.596，5.183，均P<0.05；t=5.484，5.039，均P<0.05)，聯合用藥組MMP-2的mRNA和蛋白含量低于西妥昔單抗組和紫杉醇組(t=5.876,4.895,均P<0.05；t=9.495,8.918，均P<0.05)。紫杉醇組EGRF的mRNA水平和蛋白含量低于西妥昔單抗組(t=3.143，4.371,P<0.05)，紫杉醇組MMP-2的mRNA水平和蛋白含量低于西妥昔單抗組(t=5.312,6.110,P<0.05)。見表1，圖3。

a與空白對照組比較，P<0.05；b與西妥昔單抗組和紫杉醇組比較，P<0.05

圖2不同處理組CNE-1細胞的劃痕試驗結果

表1各組細胞EGFR、MMP-2的mRNA和蛋白水平

組別EGFRmRNA水平蛋白水平MMP-2mRNA水平蛋白水平空白對照組100±23100±19100±24100±21西妥昔單抗組67±18a69±15a69±16a64±10a紫杉醇組60±17ab56±14ab64±19ab63±9ab聯合用藥組50±14abc43±13abc45±11abc36±8abcF10.38412.91712.05715.539P<0.05<0.05<0.05<0.05

a與空白對照組比較，P<0.05；b與西妥昔單抗組比較，P<0.05；c與紫杉醇組比較，P<0.05;EGFR：表皮生長因子受體；MMP-2：基質金屬蛋白酶2

3討論

紫杉醇是一種具有廣譜抗腫瘤作用的植物堿，屬于有絲分裂抑制劑，可以誘導和促進微管蛋白聚合成微管，同時抑制已形成的微管解聚，產生穩定的微管束[1]。由于微管束的正常動態再生受阻，細胞在有絲分裂時不能形成正常的有絲分裂紡錘體，染色體就不能向兩極移動，使腫瘤細胞阻滯于G2期和M期，最終阻止有絲分裂的完成，從而抑制細胞的分裂與增殖[2]。西妥昔單抗是一種抗EGFR的新型人鼠嵌合型單克隆抗體，已被作為治療浸潤進展期頭頸部鱗狀上皮細胞癌的分子靶向藥物應用于臨床，取得了滿意的療效[3]。

盡管紫杉醇和西妥昔單抗能夠促進鼻咽癌細胞的凋亡，但在兩種藥物單獨應用時并不能完全阻斷腫瘤細胞的增殖過程，因而無法有效控制鼻咽癌的發展和浸潤[4]。Sung等[5]的研究用西妥昔單抗和紫杉醇共同處理鼻咽癌細胞株，結果發現兩種能夠在抑制腫瘤增殖和遷移方面發揮協同作用。近年來，國內也逐步開展了關于鼻咽癌生物學行為方面的研究，楊永凈等[6]和黃宇賢等[7]分別報道了紫杉醇和西妥昔單抗對鼻咽癌細胞生物學行為的調節作用，但是關于兩種藥物聯合應用仍缺乏相關的研究。本研究結果顯示，西妥昔單抗組、紫杉醇組的增殖和遷移能力均低于空白對照組，這與楊永凈[6]和黃宇賢等[7]的結果相一致，西妥昔單抗和紫杉醇單獨應用均能抑制黑色素瘤細胞的增殖和遷移能力。進一步通過觀察聯合用藥組的細胞增殖和遷移能力可知，兩種藥物聯合應用能夠更為明顯地抑制細胞的遷移和增殖能力。

a與空白對照組比較，P<0.05；b與聯合用藥組比較，P<0.05；EGFR：表皮生長因子受體；MMP-2：基質金屬蛋白酶2

圖3各組細胞增殖、遷移能力比較

目前，對于西妥昔單抗和紫杉醇抗腫瘤的機制尚未闡明，其潛在的分子作用靶點仍處于未知狀態。探尋在鼻咽癌細胞增殖、遷移過程中的關鍵分子，有助于為尋找更為有效的生物治療靶點[8]。MMP-2屬于蛋白酶家族，是參與細胞外基質降解的關鍵分子，與腫瘤細胞向周圍的浸潤密切相關[2]；EGFR屬酪氨酸蛋白激酶類受體家族，參與腫瘤細胞中多種信號通路的轉導，通過下游磷脂酰肌醇3 激酶、細胞外信號調節激酶、核因子κB 等信號通路來介導細胞的增殖過程[9]。本研究通過實時定量PCR和Western-blot的方法檢測MMP-2、EGFR 的mRNA和蛋白含量可知，西妥昔單抗和紫杉醇均能抑制EGFR、MMP-2的表達；并且兩者具有協同作用，聯合給藥對EGFR、MMP-2的抑制作用更為明顯。這就說明下調EGFR、MMP-2可能是西妥昔單抗和紫杉醇發揮抗腫瘤作用的機制，同時也為臨床尋找鼻咽癌的治療提供了新的分子靶點。

綜上所述，西妥昔單抗聯合紫杉醇能夠抑制人鼻咽癌CNE-1細胞的增殖和遷移能力，這一作用可能是通過抑制EGFR、MMP-2的表達來實現的。

參考文獻

[1]姚彪,劉琳,魏萬高.多西紫杉醇聯合順鉑治療晚期復發鼻咽癌[J].中國醫藥導刊，2013，15(9)：1501-1502.

[2]李高峰，李桂生，寧四海，等.小劑量紫杉醇同步化療聯合調強放療治療復發性鼻咽癌[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(16)：241-242.

[3]高惠冰，鄭登云.西妥昔單抗聯合吉西他濱加鉑類在紫杉類藥物失敗晚期鼻咽癌中的應用[J].廣東醫學，2013，34(14)：2244-2246.

[4]Zuo Q,Shi M,Chen J,etal.The Ras signaling pathway mediates cetuximab resistance in nasopharyngeal carcinoma[J].Biomed Pharmacother,2011,65(3):168-174.

[5]Sung FL,Poon TC,Hui EP,etal.Antitumor effect and enhancement of cytotoxic drug activity by cetuximab in nasopharyngeal carcinoma cells[J].In Vivo,2005,19(1):237-245.

[6]楊永凈，劉士新，刁建東，等.紫杉醇聯合放療對鼻咽癌CNE細胞株凋亡蛋白表達的影響[J].中國實驗診斷學，2012，16(12)：2176-2178.

[7]黃宇賢，王楊，李玉華，等.西妥昔單抗對耐藥鼻咽癌 C NE2 /DDP 細胞和 NK 細胞的雙重免疫調節作用[J].中國腫瘤生物治療雜志，2010，17(3)：268-273.

[8]Liu D,Chen C,Hu G,etal.Specific targeting of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE1 by C225-conjugated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles with magnetic resonance imaging[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2011,43(4):301-306.

[9]蔣偉,張成.VEGF和Survivin蛋白表達與鼻咽癌相關性研究[J].醫學綜述，2007，14(9)：656-658.

Effects of Cetuximab Combined with Paclitaxel on Proliferation and Migration of Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line CNE-1 and Its Possible Molecular MechanismsWANGWen-hui，WANGXiao-ling.(DepartmentofMedicineandEquipment,LintongSanitoriumofLanzhouMilitaryAreaCommand,Xi′an710600,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of cetuximab combined with paclitaxel on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 and its possible molecular mechanism.MethodsNasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 were cultured and divided into blank contrast group,cetuximab group,paclitaxel group and combination group.Then cell vitality was detected by MTT,migration was detected by wound-healing assay and level of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2),epithelial growth factor receptor (EGFR) was detected by real-time PCR and Western-blot.Results①MTT value(36±7) and migration ability(21±6) of the combination group were lower than MTT value(62±10) and migration ability(55±10) of the cetuximab group,MTT value(59±11) and migration ability(57±10) of the paclitaxel group(P<0.05).②EGFR,MMP-2 mRNA levels (50±14),(45±11) of the combination group were lower than (67±18),(69±16) of the cetuximab group,(60±17),(64±19) of the paclitaxel group(P<0.05);EGFR,MMP-2 protein levels (43±13),(36±8) of the combination group were lower than (69±15),(64±10) of the cetuximab group and (56±14),(63±9) of the paclitaxel group(P<0.05).ConclusionCetuximab combined with paclitaxel can reduce the migration and proliferation ability of carcinoma cell line CNE-1,and inhibition on MMP-2,EGFR might be the molecular mechanisms.

Key words:Nasopharyngeal carcinoma; Cetuximab; Paclitaxel; Proliferation; Migration

收稿日期：2014-11-14修回日期：2014-05-03編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.20.066

中圖分類號：R979.1

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)20-3822-04