脾氣虛大鼠骨骼肌組織Ca2+/ CaM 信號通路關鍵分子動態表達規律

段永強　梁玉杰　成映霞　杜　娟　楊曉軼　程衛東　劉　靚　高建德　安耀榮　王　燕(甘肅中醫學院　甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅　蘭州　73000)

脾氣虛大鼠骨骼肌組織Ca2+/ CaM 信號通路關鍵分子動態表達規律

段永強梁玉杰1成映霞1杜娟楊曉軼程衛東2劉靚1高建德安耀榮1王燕1
(甘肅中醫學院甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅蘭州730020)

〔摘要〕目的觀察脾氣虛大鼠骨骼肌組織Ca2+/鈣調蛋白(CaM)信號通路中關鍵分子〔Ca2+〕i以及CaM、鈣調蛋白激酶(CaMK)Ⅱ、p-CaMKⅡ蛋白表達水平的變化。方法受試動物隨機分為正常對照組，脾虛模型7、14、21 d組，每組12只。除正常對照組外，其余受試動物采用復合法(苦寒破氣法、游泳力竭法及饑飽失常法)成功建立脾氣虛證大鼠模型，在觀測各組大鼠一般生存狀態、胃腸轉運功能和骨骼肌組織ATP酶活性的基礎上，采用激光共聚焦技術檢測骨骼肌組織細胞內〔Ca2+〕i濃度，蛋白免疫印跡技術檢測骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ的表達變化。結果與空白組比較，脾氣虛大鼠隨著造模時間的延長，胃殘留率升高而小腸推進率下降(P＜0.01) ;骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均降低(P＜0.05，P＜0.01) ;骨骼肌組織〔Ca2+〕i濃度和CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表達量顯著降低(P＜0.01) ;且脾虛模型7 d、14 d、21 d組之間比較，以脾虛21 d組變化更為顯著。結論脾虛大鼠骨骼肌組織Ca2+/CaM信號通路關鍵分子CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白以低表達為主。

〔關鍵詞〕脾氣虛證; Ca2+/CaM信號通路;骨骼肌

1甘肅中醫學院甘肅省中藥新產品創制重點實驗室

2蘭州大學基礎醫學院中西醫結合研究所

第一作者:段永強(1974-)，男，副教授，醫學博士，主要從事中醫臨床基礎，中醫脾胃病的科研和臨床工作。

Expression changes of Ca2+/CaM signaling pathways key factors in skeletal muscle tissue of rats with spleen-qi deficiency

DUAN Yong-Qiang，LIANG Yu-Jie，CHENG Ying-Xia，et al.
Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicines of Gansu Province，Gansu College of TCM，Lanzhou 730020，Gansu，China

【Abstract】Objective To investigate the expression changes of Ca2+/CaM signaling pathways key factors〔Ca2+〕i，CaM，CaMKⅡand p-CaMKⅡin skeletal muscle tissue of rats with spleen-qi deficiency．Methods The rats were randomly divided into normal control，spleenqi deficient model groups(observed on 7 d，14 d and 21 d)，12 rats in each．The spleen-qi deficient model rats were made by rhubarb，exhaustive and hungry method，then general existence，gastric remnant rate，intestinal propulsion rates，and ATPase activity related to metabolism were evaluated．Also，confocal laser technology was used to test cellular〔Ca2+〕i concentration and Western blot was used to test CaM，CaMKⅡ，p-CaMKⅡexpressions in skeletal muscle of spleen asthenia rats．Results Compared with that of normal group，gastric remnant rate was increased and small intestinal propulsion rates were decreased(P＜0．01)，the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase were decreased significantly(P＜0．01，P＜0．05)，and the expressions of CaM，CaMKⅡ，p-CaMKⅡin skeletal muscle tissue were decreased，these differences were obvious on spleen-qi deficient model 21 d group(P＜0．01)．Conclusions The〔Ca2+〕i concentrations，CaM，CaMKⅡand p-CaMKⅡabnormaly decreased might be one of the pathological mechanisms of spleen-deficiency．

【Key words】Spleen-qi deficiency; Ca2+/CaM signaling pathways; Skeletal muscle

中醫認為“脾主運化”為氣血生化源，“脾氣散精”而將水谷精微輸布全身，內至五臟六腑、外達四肢百骸，充養肌體，故有“脾主身之肌肉”之理論;如《黃帝內經·素問·藏氣法時論篇》云:“脾病者，身重，善饑肉痿，足不收行，善瘈，腳下痛。虛則腹滿，腸鳴飧泄，食不化”，嚴重脾虛會導致氣血不足，肌肉失養而萎廢不用。本文在研究脾氣虛大鼠一般生存狀態、胃腸轉運功能和骨骼肌組織能量代謝相關酶活性的基礎上，觀察骨骼肌組織中Ca2+/CaM信號通路關鍵分子〔Ca2+〕i以及鈣調蛋白(CaM)、鈣調蛋白激酶(CaMK)Ⅱ、p-CaMKⅡ蛋白的表達變化規律。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物3月齡SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，體質量180～190 g，甘肅中醫學院醫學實驗中心提供，動物合格證號: SCXK(甘) 2011-0001-0001011;實驗設施合格證號: SYXK(甘) 2011-0001-0000314。本實驗中動物處理的相關程序遵守中國國家健康與醫學研究委員會(NHNRC)動物道德準則并得到了甘肅中醫學院動物實驗倫理委員會的批準。

1.1.2藥物與試劑中藥均購自蘭州復興厚中藥材有限責任公司。大黃、厚樸、枳實按2∶1∶1組成，以上方藥分別常規煎煮、去渣濾出藥液加熱濃縮至每1 ml藥液含生藥2 g，冷卻后置4℃冰箱備用，使用時稀釋至所需濃度。

鈣鎂ATP酶試劑盒(Ca2+-Mg2+-ATPase，批號20130328)、鈉鉀ATP酶試劑盒(Na+-K+-ATPase，批號20130330)，購自南京建成生物工程研究所;考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(批號20130326)購自南京建成生物工程研究所; Flou-3/AM鈣離子熒光染色劑(批號D00147366)購自EMD Chemicals公司;抗CaM抗體、抗CaMKⅡ抗體、p-CaMKⅡ抗體(批號0002、0006)購自Cell Singaling公司;內參GAPDH(批號ZS-25778)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(批號ZB-2301)購自北京中杉金橋;磷酸酶抑制劑混合物(批號P1260)、BSA胎牛血清白蛋白(批號1213G052)購自北京索萊寶生物科技有限公司;總蛋白提取試劑盒(批號PC0020)、蛋白質定量試劑盒(BCA法，批號P1511)購自北京普利萊基因技術有限公司;超敏發光液(批號090925)購自bio world公司;氯仿，無水乙醇，異丙嗪，甲醇均為國產分析純試劑。

1.1.3主要儀器Biomate 3S超微量分光光度計，美國Thermo Fisher公司; Chemi DOC XRS+凝膠成像分析系統、CFX96TM Optics Module PCR儀、BIOMATE 3S核酸蛋白測定儀、Powerpac basic基礎電泳儀，美國BIO-RAD公司; KDC-2044低速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司; VT1000S震動切片機，德國Leica公司; Fluoview FV1000激光共聚焦顯微鏡，日本O-lympus公司; VELOCITY 18R高速臺式低溫離心機，澳大利亞Dynamically公司; Hirayama HVE-50高壓滅菌器，日本Hirayama公司; P70D20P-TD(W0)微波爐，格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.2方法

1.2.1分組與造模48只SPF級Wistar大鼠適應性飼養1 w后，按體重從小到大編號，采用隨機數字表法分為正常對照組、脾虛模型組(7、14、21 d)，每組12只，雌雄各半分籠飼養。以苦寒破氣法(大黃、枳實、厚樸)、游泳力竭法及饑飽失常法三因素復合法復制脾氣虛證模型〔1，2〕: (1)苦寒破氣法:造模組大鼠每日上午按7.5 g/kg大黃枳實厚樸制劑液灌胃，1次/d。(2)游泳力竭法:每日下午2∶00使大鼠負重游泳，于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體重10％的保險絲，放入水深50 cm、水溫20℃的水槽中游泳，并記錄大鼠游泳耐力時間，以游泳力竭(即大鼠鼻尖沒入水面10 s)為度，1次/d。(3)饑飽失常法:每日上午8∶00給予定量飼料，下午8∶00撤去飼料并稱量剩余量，隔日再給予定量飼料，自由飲水。造模期間，正常對照組大鼠每日上午按1 ml/100 g體重灌服生理鹽水，并給予抓捏刺激，每日上午、下午各1次給予定量飼料，稱量剩余量，自由飲水。

1.2.2標本采集造模時分別于第7、14、21日取材并制備待檢樣本。各組大鼠于末次灌胃給藥后，禁食不禁水24 h，烏拉坦(1 g/kg)麻醉采血后斷頭處死并制備待檢標本。血清制備:股動脈取血4 ml，靜置2 h后2 000 r/min離心10 min，取上清，放入尖底管中4℃低溫冰箱保存備用。骨骼肌組織的收集:動物處死后，迅速將近股四頭肌組織截取于激光共聚焦檢測備用，另一部分骨骼肌組織置于用DEPC處理過的凍存管中，－80℃冷凍保存備用，檢測CaM、CaMKⅡ相關蛋白表達。

1.2.3各組大鼠胃排空率和小腸推進率測定胃排空率實驗〔3〕:分別隨機抽取各組大鼠8只，禁食不禁水24 h后，給半固體營養糊2 ml，30 min后用10％水合氯醛麻醉后股動脈采血，制備待檢標本。隨后迅速打開腹腔，結扎幽門和賁門后取出胃，清除胃表面的血漬，第一次稱重(胃總重)后剪開胃體，洗去胃內容物，用濾紙吸干水分第二次稱重(胃凈重)，胃排空率按公式計算:胃排空率=(胃總重－胃凈重)÷所給糊重×100％

小腸推進率實驗〔4〕:結扎幽門和回盲部，分離腸系膜，測量幽門至回盲部的長度作為小腸總長度，從幽門至營養糊黑染的距離作為小腸推進長度。小腸推進率按公式計算:小腸推進率=營養糊推進距離(cm)÷小腸全長(cm)×100％。

1.2.4各組大鼠骨骼肌組織中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性測定大鼠麻醉采血后迅速斷頭處死，低溫條件下快速取骨骼肌組織，以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，準確稱重后置于勻漿器中用9倍生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)，制成1％的骨骼肌組織勻漿液，后以3 500 r/min離心10 min，取上清液，同時用考馬斯亮藍法做蛋白定量，其余上清液置4℃冰箱保存備用，Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性測定按照試劑盒操作步驟進行。

1.2.5激光共聚焦檢測骨骼肌細胞〔Ca2+〕i濃度將一部分骨骼肌組織快速冷凍后固定于盛有培養液的振蕩切片機后固定切片，切片厚度約200 μm，將切片用專用毛刷小心移入培養皿中，用PBS液沖洗骨骼肌組織切片2遍，加入10 μmol/L染料液1 ml，置于37℃的CO2孵箱里避光溫育30 min。再將染色后的組織切片用PBS液沖洗三遍，加入1 ml含小牛血清的DMEM培養液后置于20倍光學顯微鏡觀察區域及層面，用激光共聚焦顯微鏡觀察Flou-3AM染色的組織細胞的某一層面的熒光圖像;啟動激光共聚焦顯微鏡，選擇488 nm氬離子激光采集〔Ca2+〕i熒光圖像并連續拍攝圖片后進行掃描分析。

1.2.6蛋白免疫印跡檢測骨骼肌組織中CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表達各組分別于造模7 d、12 d及21 d結束后麻醉處死并截取骨骼肌組織。用蛋白提取試劑盒(磷酸化蛋白檢測加入磷酸酶抑制劑)提取組織蛋白。BCA試劑盒進行蛋白定量，以20 μg/道上樣進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜后，用5％牛血清白蛋白封閉后分別加入一抗: 4℃搖床過夜，洗滌后加入HRP標記羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，采用化學發光底物進行化學發光，暗室曝光，顯影定影后用Bio-RAD Quantity one圖像分析軟件進行掃描分析。

1.3統計學方法采用SPSS13.0軟件，組間樣本均數的比較選用F檢驗，再用q檢驗進行兩兩比較。

2　結果

2.1各組大鼠一般生存情況正常對照組大鼠始終表現為反應靈敏、活動及飲食量正常，被毛濃密柔順而有光澤，糞便呈棕褐色顆粒狀。脾虛模型各組大鼠多數在第5天即開始出現倦臥、被毛稀疏干枯;第7天后出現怠動少食、肛周污穢，甚至動作遲緩;第14天后出現怠動少食、消瘦弓背、肛周污穢，部分動物出現脫肛、動作遲緩，并逐漸出現體重減輕、大便稀軟呈橘黃色，而且隨著造模時間的延長上述癥狀表現突出;尤其在脾虛21 d組中，隨著造模時間的延長，大鼠生存能力明顯下降，表現為怠動少食、消瘦弓背、毛發枯槁疏散、肛周污穢，部分大鼠瞇眼蜷縮，反應遲鈍，體重增長明顯減緩。

2.2脾虛各組大鼠胃殘留率和小腸推進率的比較與正常對照組比較，脾虛模型7 d組大鼠胃殘留率稍有降低趨勢，但組間無統計學差異(P＞0.05)，脾虛模型14 d、21 d組大鼠胃殘留率顯著升高(P＜0.05，P＜0.01) ;脾虛模型7 d、14 d組大鼠小腸推進率顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，而脾虛模型21 d組大鼠小腸推進率顯著降低，與脾虛7 d組比較有統計學差異(P＜0.01)，見表1。

表1　脾虛各組大鼠胃殘留率和小腸推進率的比較(±s，n=8，％)

表1　脾虛各組大鼠胃殘留率和小腸推進率的比較(±s，n=8，％)

與正常對照組比較: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;與脾虛模型7 d組比較: 3) P＜0.05，4) P＜0.01;下表同

組別　胃殘留率　小腸推進率正常對照組脾虛模型7 d組脾虛模型14 d組脾虛模型21 d組41.93±6.50 39.20±4.94 45.70±5.663)51.85±7.472) 4)43.55±5.95 49.98±4.391)52.80±6.782)41.14±2.894)

2.3脾虛各組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性的比較與正常對照組比較，脾虛模型7 d組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性有降低趨勢，但組間無統計學差異(P＞0.05)，模型14 d、21 d組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性下降顯著(P＜0.01) ;與脾虛模型7 d組比較，模型21 d組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低更為顯著(P＜0.01，P＜0.05)。見表2。

表2　脾虛各組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性比較(±s，U/mg prot)

表2　脾虛各組大鼠骨骼肌組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性比較(±s，U/mg prot)

組別　n　 Na+-K+-ATPase　 Ca2+-Mg2+-ATPase正常對照組脾虛模型7 d組脾虛模型14 d組脾虛模型21 d組10 10 98 1.94±0.28 1.80±0.22 1.58±0.171) 2)1.39±0.252) 4)0.47±0.09 0.46±0.07 0.38±0.092)0.31±0.082) 3)

2.4脾虛各組大鼠骨骼肌〔Ca2+〕i濃度的比較與正常對照組骨骼肌組〔Ca2+〕i熒光值(45.29±3.137)比較，脾虛模型7 d組、14 d大鼠骨骼肌組織〔Ca2+〕i濃度顯著降低，但組間差異無統計學意義(44.25±3.318，43.60±2.127，P＞0.05)，模型21 d組大鼠骨骼肌組織〔Ca2+〕i濃度顯著降低(41.70±2.904) (P＜0.05)，但各組模型間比較無統計學意義(P＞0.05)，見圖1。

圖1　脾虛各組大鼠骨骼肌組織〔Ca2+〕i濃度熒光圖

2.5脾虛各組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表達比較與正常對照組比較，脾虛模型7、14 d組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ蛋白表達量有降低趨勢，但組間無統計學差異(P＞0.05)，脾虛模型21 d組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ蛋白表達量顯著降低，且與脾虛模型7 d組比較差異顯著(P＜0.05) ;而脾虛7 d組大鼠骨骼肌組織p-CaMKⅡ蛋白表達量有降低趨勢，但組間無統計學差異(P＞0.05)，脾虛模型14、21 d組大鼠骨骼肌組織p-CaMKⅡ蛋白表達量顯著降低，且與脾虛模型7 d組比較差異顯著(P＜0.01)。見表3，圖2。

表3　脾虛各組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表達灰度值比較(±s，n=10)

表3　脾虛各組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表達灰度值比較(±s，n=10)

組別　CaM　CaMKⅡ　p-CaMKⅡ正常對照組脾虛模型7 d組脾虛模型14 d組脾虛模型21 d組0.34±0.033 0.33±0.041 0.31±0.042 0.28±0.0351) 3)0.53±0.037 0.53±0.049 0.51±0.053 0.46±0.0681) 3)0.62±0.031 0.60±0.041 0.52±0.0692) 4)0.51±0.0672) 4)

圖2　各組大鼠骨骼肌組織CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白免疫印跡表達圖

3　討論

脾氣虛證作為中醫臨床常見的臟腑疾病證候之一，主要以消化道功能障礙或減弱為主的全身性生理功能減弱的綜合臨床表現。中醫認為“脾主運化”，“脾氣散精”而將水谷精微輸布全身，內至五臟六腑、外達四肢百骸，充養肌體，故有“脾主身之肌肉”之理論;脾主運化即是現代醫學所指胃腸消化吸收功能，若有脾主運化功能失調(即脾虛證)就會使消化吸收過程產生相應的病癥，如納呆少食、嗜臥倦怠、四肢無力、便溏不調等，嚴重脾虛可導致機體神疲乏力、形體消瘦甚至肌肉萎廢不用等癥狀。本實驗建立的脾氣虛模型癥候群與《實驗動物和動物實驗技術》〔5〕和《醫學實驗動物學》〔6〕描述的大鼠生理特點、《實用中醫證候動物模型學》〔7〕以及總結近10年醫學期刊文獻資料建立的脾虛大鼠癥狀評價標準〔8〕的依據相吻合。同時在本實驗中我們觀察到，隨著造模時間的延長，上述癥狀表現更加突出，在18 d后大鼠生存能力明顯下降。

中醫認為“脾主運化，胃主受納;脾以升為健，胃以降為和”，并以此概念概括脾胃消化吸收及轉運功能，所以脾胃升降運動包含著胃腸動力的生理概念;脾胃虛弱，運化無力，胃失和降，升降失常，是脾胃運化功能失常的基本病理特點〔9〕。李志等〔10〕通過臨床研究證明脾虛患者胃半排空時間延長;動物實驗表明脾虛大鼠存在胃腸轉運功能紊亂;廖志航等〔11〕通過研究大黃水煎液所復建的脾虛小鼠模型，結果顯示脾虛小鼠小腸墨汁推進率升高，而胃排空實驗提示胃排空時間縮短。本研究結果表明，在造模初期，受試大鼠胃腸排空時間縮短，可能與造模藥物大黃、枳實、厚樸有效組分興奮胃腸平滑肌有關;隨著造模時間延長，脾虛后期大鼠胃腸排空時間延長，存在胃腸轉運功能紊亂，而在造模過程中出現小腸排空功能先興奮后抑制的動態變化，可能與小腸消化間期移行性肌電復合波(MMC)、移行性運動復合波(MMC)以及慢波頻率和快波頻率紊亂有關。

同時基于脾虛證的發生涉及消化、內分泌、免疫、中樞神經、運動系統等諸多系統功能紊亂的共識〔12〕，而這些系統生理功能的紊亂必然導致某些具體器官生理功能紊亂。故本研究選取反映組織器官基本生理功能的代謝相關酶Ca2+-Mg2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性作為評判脾虛大鼠骨骼肌基本生理功能是否有變化。Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)亦稱鈣泵，是衡量細胞線粒體功能和能量代謝水平的一個重要的指標〔13〕。由于其活性依賴于ATP與Mg2+的結合，所以又稱為Ca2+-Mg2+-ATPase，此酶能夠催化質膜內側的ATP水解，釋放出能量，其活性降低可引起細胞離子跨膜轉運障礙及胞質內Ca2+穩態失衡，導致細胞的形態結構和生理功能異常〔14〕。位于細胞膜上的Na+-K+-ATPase又稱鈉泵，與ATP分解和細胞內外鈉、鉀離子的轉運密切相關，對維持細胞能量代謝和生理功能具有重要作用〔15〕，如曾益宏等〔16〕研究發現脾虛大鼠骨骼肌細胞膜Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性均顯著降低。本實驗條件下的研究結果表明，脾虛大鼠骨骼肌組織有關能量代謝相關酶的活性降低。

在Ca2+/CaM細胞信號通路中，CaM作為細胞內Ca2+受體可與Ca2+可逆性結合，進一步可激活下游Ca2+-CaM依賴的蛋白激酶-CaMKⅡ而發揮生物學作用，而且CaM牽連許多細胞內生理過程，包括調節骨骼肌、平滑肌的收縮和舒張〔17，18〕。在本實驗條件下的研究結果表明脾虛模型大鼠骨骼肌組織〔Ca2+〕i濃度顯著降低，CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表達量亦降低，其發生機制可能與在脾虛造模過程中，多因素造模法導致大鼠攝食量減少，物質代謝降低以及便次增多(脾虛腹瀉)，血鈣濃度下降，從而使組織細胞內〔Ca2+〕i濃度下降，并影響下游關鍵分子CaM、CaMKⅡ的表達以及p-CaMKⅡ的活化，故提示脾氣虛大鼠骨骼肌組織Ca2+/CaM信號通路關鍵分子CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白以低表達為主，其中的深層次機制值得進一步研究。

4　參考文獻

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〔2015-02-15修回〕

(編輯李相軍)

基金項目:國家自然科學基金項目(81160420) ;甘肅省自然科學基金項目(1010RJZA148) ;甘肅省教育廳基金項目(1006-05)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 15-4127-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.008