逍遙散對阿爾茨海默病模型大鼠海馬mRNA 表達的影響

李高申　郭梅珍　趙唯賢(黃河科技學院，河南　鄭州　450006)

逍遙散對阿爾茨海默病模型大鼠海馬mRNA 表達的影響

李高申郭梅珍趙唯賢1
(黃河科技學院，河南鄭州450006)

〔摘要〕目的探討疏肝理氣方劑逍遙散對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠海馬mRNA表達的影響。方法將4～5個月鼠齡，體重(250± 20) g的清潔級SD雄性大鼠隨機分為4組，其中模型組、西藥組、中藥組采用D-gal腹腔注射和Aβ1～42雙側海馬注射聯合造模;生理組采用等體積滅菌生理鹽水按上述方法象征性造模。造模完成后，生理組、模型組以生理鹽水灌胃，西藥組和中藥組分別采用奧拉西坦溶液和逍遙散煎劑灌胃。四組均每日1次，連續灌胃28 d，用藥體積0.5 ml/100 g。結果經灌胃干預后，中藥組水迷宮成績較模型組提高明顯(P＜0.01) ;大鼠海馬中蛋白磷酸酶-2A基因表達明顯增加(P＜0.01)，細胞依賴性蛋白激酶-5、糖原合成酶激酶-3β的基因表達明顯減少(P＜0.01)。結論逍遙散通過上調蛋白磷酸酶-2A基因表達和下調細胞依賴性蛋白激酶-5、糖原合成酶激酶-3β基因表達，對凝聚態Aβ1～42peptide誘導的海馬Tau蛋白過度磷酸化有一定抑制作用，對大鼠AD模型記憶能力的改善起到了一定影響。

〔關鍵詞〕逍遙散;阿爾茨海默病;糖原合成酶激酶-3β;細胞依賴性蛋白激酶-5;蛋白磷酸酶-2A

1河南醫學高等?？茖W校

第一作者:李高申(1971-)，男，碩士，副教授，主要從事中醫教學與基礎研究。

阿爾茨海默病(AD)是以漸進性記憶、認知功能障礙為特點的中樞神經系統退行性疾病，神經元內神經元纖維纏結是AD的重要病理學特征。本研究擬觀察逍遙散對調控AD Tau蛋白過度磷酸化相關蛋白激酶及蛋白磷酸酶基因表達水平的影響，旨在為篩選有效抗AD中藥提供依據。

1　材料與方法

1.1動物清潔級SD雄性大鼠，鼠齡4～5個月，體重(250± 20) g，購自河南省實驗動物中心，批號: SCXX(豫) 2010-0002。

1.2藥物逍遙散煎劑(組成:柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、炙甘草、生姜、薄荷)各藥間質量比例按原方10∶10∶10∶10∶10∶5∶1∶1配比，由本課題組在每日用藥前2 h，嚴格按照中藥煎劑制備流程自行制作，最后經水浴箱蒸發濃縮至含生藥2 g/ml的藥液濃度，晾至常溫備用。奧拉西坦膠囊(石藥集團歐意藥業有限公司提供，400 mg/粒，批號: 05110703)，用藥前，將奧拉西坦藥粉用常溫蒸餾水稀釋成150 mg/ml的奧拉西坦溶液備用。

1.3試劑D-半乳糖(D-gal)，Genview公司生產，北京鼎國昌盛生物技術有限公司分裝，批號22L10133;β-淀粉樣蛋白(Aβ) 1～42，北京博奧森生物技術有限公司提供，批號: 990901;海馬蛋白磷酸酶(PP) -2A抗體，abgent生產，編號AJ1644a;糖原合成酶激酶(GSK) -3β抗體，GST生產，編號9315s。

1.4儀器藍星B型腦立體定位儀2H，安徽淮北正華生物儀器設備有限公司生產; DMS2型Morris水迷宮系統，中國醫學科學院藥物研究所生產;潔凈工作臺，上海博迅實業有限公司醫療設備廠; DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司生產。

1.5方法

1.5.1動物分組全部大鼠適應性喂養3 d，光照節律12 L: 12 D(6∶00～18∶00)，室溫22℃～24℃，濕度30％～40％，自由飲水，喂食河南省實驗動物中心提供的普通大鼠顆粒飼料。將每只大鼠用苦味酸進行染色標記，水迷宮連續訓練3 d，留用尋找平臺平均時間較短者作為實驗用鼠，并隨機分為四組(生理組、模型組、西藥組、中藥組)，每組7只。

1.5.2模型制備模型組、西藥組、中藥組均采用D-gal腹腔注射和Aβ1～42雙側海馬注射聯合造?！?〕:①每天9∶00～10∶00，按1 ml/100 g的劑量分別對各組大鼠腹腔注射D-gal溶液(濃度10 mg/ml)，連續42 d;②將Aβ1～42加生理鹽水稀釋成5 μg/μl的溶液，震蕩溶解，密封，37℃溫箱中孵育7 d，使其變為凝聚態Aβ，放入4℃冰箱保存備用。自D-gal造模次日(第43天)，大鼠經10％水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，常規皮膚消毒，頭部正中矢狀切口，以前囟為基準點，后移4 mm，左右旁移2 mm，確定左右側海馬注射點。用牙科鉆在海馬注射點鉆開顱骨，暴露硬腦膜，用微量注射器針頭進入大腦1.6 mm到達海馬組織。在20 min內將2 μl Aβ緩慢注入雙側海馬，以保證溶液充分彌散。然后緩慢撤針，以滅菌骨蠟填補骨孔，縫合皮膚，碘伏消毒。每只腹腔注射青霉素鈉預防感染，1次/d，連用3 d。常規飼養。生理組用等體積滅菌生理鹽水做上述操作完成造模。

1.5.3藥物干預造模結束后的第4天，每日9∶00～11∶00進行藥物灌胃干預。生理組、模型組采用生理鹽水灌胃，西藥組和中藥組分別采用奧拉西坦溶液和逍遙散煎劑灌胃。各組均每日1次，連續28 d，用藥體積均為0.5 ml/100 g。

1.5.4行為學檢測〔2〕各組在藥物干預結束后的次日，再次進行水迷宮行為學實驗。大鼠分別自第1～4象限放入，觀察并記錄各象限大鼠從入水到找到安全平臺所用的時間。實驗每日1次，連續實驗3 d，取其3 d的平均值進行統計比較。

1.6取材及實驗方法

1.6.1取材行為學測試結束，各組經10％水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔麻醉，斷頭，在超凈臺內冰塊上迅速剝離海馬，分別放入1.5 ml滅菌離心管內，密封并標記，埋入干冰，迅速轉移至－70℃低溫冰箱中保存。

1.6.2RNA抽提和質量檢測從少量組織(1～10 mg)或細胞(102～104)樣品中抽提RNA，加入800 μl TRIZOL試劑至樣品中，樣品裂解后，加氯仿兩相分離。質量檢測主要采用紫外吸收測定法和變性瓊脂糖凝膠電泳法〔3〕。

1.6.3引物設計由上?？党缮锕こ坦竞铣?，GSK-3β正義引物: 5＇CCGCCCGGCTAACACCACTG 3＇，反義引物: 5＇GTGCTGGTCTTTCCCGCGCA 3＇，退火溫度60℃，產物長度326 bp; cdk-5正義引物: 5＇CCGGGGCCGGGAGTCTTAGAA3＇，反義引物: 5＇CCGGAGGGCTGAACTTGGCAC3＇，退火溫度60℃，產物長度204 bp; PP-2A正義引物: 5＇TGAGCTGCCTGCAGAAATGTAAGGC 3＇，反義引物: 5＇TCTGCAGAGCTGGGAAGCCCAA 3＇，退火溫度60℃，產物長度96 bp; GAPDH正義引物: 5＇GGAAAGCTGTGGCGTGAT3＇，反義引物: 5＇AAGGTGGAAGAATGGGAGTT3＇，退火溫度59℃，產物長度308 bp。

1.6.4實時定量PCR方法將所有cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應體系，配置: dNTP(每個2.5 mmol/L) 1.0 μl，10×PCR緩沖液1.0 μl，MgCl2溶液0.6 μl，Taq聚合酶0.5 U，10 μmol/L的PCR特異引物各0.4 μl，2×ROX Reference Dye 0.2 μl，加水至總體積為8 μl。將384-PCR板置于Realtime PCR儀上進行PCR反應: GAPDH: 95℃，3 min; 40個PCR循環〔95℃，15 s; 59℃，20 s; 72℃，20 s; 83℃，20 s(收集熒光)〕。PP-2A: 95℃，3 min; 40個PCR循環〔95℃，15 s; 60℃，20 s; 72℃，20 s; 81℃，20 s(收集熒光)〕。GSK-3β: 95℃，3 min; 40個PCR循環〔95℃，15 s; 60℃，20 s; 72℃，20 s; 86℃，20 s(收集熒光)〕。cdk-5: 95℃，3 min; 40個PCR循環〔95℃，15 s; 60℃，20 s; 72℃，20 s; 83℃，20 s(收集熒光)〕。

1.7統計學方法應用SPSS11.5軟件行單因素方差分析。

2　結果

2.1行為學實驗生理組與模型組比較水迷宮成績占明顯的優勢〔(12.18±1.68) s vs(18.63±1.71) s〕(P＜0.01)。藥物干預后，西藥組〔(15.09±2.69) s〕、中藥組〔(14.66±2.78) s〕與模型組比較，水迷宮成績提高明顯(P＜0.01)。

2.2海馬相關指標mRNA的表達與生理組比較，模型組PP-2A表達減少(P＜0.01)，細胞依賴性蛋白激酶-5(cdk-5)、GSK-3β表達增多(P＜0.01) ;與模型組比較，中藥組海馬PP-2A表達增多(P＜0.01)，cdk-5、GSK-3β表達減少(P＜0.01)。見表1。

表1　各組海馬相關指標mRNA表達的相對含量比較(±s)

表1　各組海馬相關指標mRNA表達的相對含量比較(±s)

與生理組比較: 1) P＜0.01;與模型組比較: 2) P＜0.01

組別　PP-2A/GAPDH　 cdk-5/GAPDH　 GSK-3β/GAPDH生理組　0.308 3±0.017 5　 0.106 2±0.004 5　 0.083 0±0.004 2模型組0.096 3±0.006 81)0.309 5±0.000 91)　0.267 7±0.013 51)西藥組0.160 3±0.003 72)0.208 4±0.009 42)　0.162 2±0.008 92)中藥組0.237 8±0.004 62)0.186 2±0.008 52)　0.125 9±0.009 12)

3　討論

AD患病率隨年齡增高而增高。在發達國家，AD已成為繼心臟病、癌癥、中風后的第四位死因。有資料顯示，我國現有約500萬AD患者〔4〕。隨著人類平均壽命的延長和人口老齡化的出現，AD對人類健康的危害將變得日益突出。

Aβ是老年斑(SP)的主要成分，其大量沉積可能是所有因素引起AD的共同途徑。Aβ的神經毒性作用已被公認為是AD形成的核心環節，減少Aβ的形成、抑制Aβ的沉積，是預防和治療AD的根本途徑〔5〕。

tau蛋白的病理變化出現在AD早期，有資料顯示大多數病人腦脊液中的tau蛋白升高，而量化測定腦脊液中的tau蛋白可能成為AD早期診斷的一項有用指標〔6〕。CDK-5和GSK-3β屬于蛋白激酶，其活性的增加可使tau蛋白發生異常磷酸化。CDK-5基因在大鼠腦組織中的過量表達常導致動物出現AD樣tau過度磷酸化和空間記憶障礙〔7〕;而PP-2A屬于蛋白磷酸酯酶，在信號傳導中承擔負性調節作用，其活性增加可使過度磷酸化的tau蛋白發生去磷酸化〔8〕。本研究結果也表明了PP-2A基因表達形式與CDK-5、GSK-3β基因表達呈負相關。

中醫臨床將AD歸屬于呆病門類，其發病和心、肝、脾、腎都有密切聯系，目前較多的研究主要集中在腎功能失調方面，多采用補腎益智方藥治療〔9〕。但是，肝在癡呆發病中也居重要地位。肝疏泄功能失常，肝氣郁滯，失其調達之性，其調節情志、調暢氣機功能障礙，氣血運行不暢，可導致健忘(癡呆)。如《素問·玉機真臟論》曰:“春脈如弦，......太過則令人善忘，忽忽眩暈而巔疾”。陳士鐸在《辨證錄》中指出，“人有氣郁不舒，忽忽如有所失，目前之事竟不記憶，一如老人之善忘，此乃肝氣之滯，非心腎之虛耗也”。疏肝理氣法可以運用到記憶、認知障礙疾病的臨床治療中〔10〕。

逍遙散是肝郁血虛，脾失健運的重要方劑。方中有柴胡疏肝解郁，當歸、白芍養血柔肝，白術、茯苓健脾去濕，炙甘草益氣補中，生姜溫胃和中，薄荷助柴胡疏肝解郁，體現了肝脾同治，重在治肝之法。現代研究表明，柴胡能改善腦細胞代謝和腦循環，延緩衰老引起的活性氧自由基的反應速度;當歸對腦缺血引起的空間認知障礙有一定改善作用;白芍總苷能改善東莨菪堿誘發的小鼠空間識別障礙;茯苓長期服用可使老齡大鼠內在性膽堿和乙酰輔酶-A的含量增加，有抑制抗膽堿的作用。以疏肝解郁為主治療AD，除有助于改善患者的記憶力減退等癥狀外，還可顯著改善其情緒抑郁、反應遲鈍的狀態，這對于減輕進一步的智能損害、防止病情加重具有重要的臨床意義〔11〕。

綜上，逍遙散改善了模型大鼠的認知障礙。逍遙散可能上調PP-2A的表達和下調CDK-5、GSK-3β的表達，進而對凝聚態的Aβ1～42誘導的海馬Tau蛋白過度磷酸化起到了一定的抑制作用，對AD模型大鼠起到了一定的治療作用。

4　參考文獻

1李林，茹立強.D-半乳糖-Aβ復合造模致大鼠學習記憶功能障礙及丹參酮治療作用的研究〔J〕．江西醫學院學報，2009; 49(1) : 13-6.

2趙唯賢，李高申，范新六，等.柴胡疏肝散對阿爾茨海默病大鼠記憶功能的相關研究〔J〕．中國實驗方劑學雜志，2012; 18(10) : 207-10.

3Xiang X，Qiu D，Hegele RD，et al．Comparison of different methods of total RNA extraction for viral detection in sputum〔J〕．J Virol Methods，2001; 94(1/2) : 129.

4洪震.我國近年阿爾茨海默病流行病學研究現狀與展望〔J〕．老年醫學與保健，2005; 11(4) : 195-7.

5孟祥微，王丹，申寶忠，等.阿爾茨海默病的磁共振成像研究進展〔J〕．現代生物醫學進展，2013; 13(5) : 970-2，990.

6Andreasen N，Minthon L，Clarberg A，et al．Sensitivity，specificity，and stability of CSF-tau in AD in a community based patient sample〔J〕．Neurology，1999; 53(7) : 1488-94.

7Bhat RV，Budd-Haeberlein SL，Avila J．Glycogen synthase kinase 3: a drug target for CAN therapies〔J〕．J Neurochem，2004; 89(6) : 1313-7.

8Stokin GB，Lillo C，Falzone TL.Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease〔J〕．Science，2005; 307(5713) : 1282.

9唐學敏，張運克，周英武，等.補腎益氣活血法治療血管性癡呆病經驗〔J〕．中醫雜志，2013; 54(11) : 968-9.

10黃書慧.顏乾麟運用古方治療老年性癡呆經驗〔J〕．中醫雜志，2008; 49(2) : 112-3.

11朱振鐸，霍青，薛一濤.疏肝解郁，滋腎養心法治療老年性癡呆34例臨床研究〔J〕．山東中醫藥大學學報，1998; 22(5) : 346-8.

〔2015-03-17修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:郭梅珍(1971-)，女，講師，主要從事中醫藥教學與基礎研究。

基金項目:河南省2012年度科技計劃項目(No．122102310410) ;河南省教育廳青年骨干教師資助項目(No．2011GGJS-220)

〔中圖分類號〕R749

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 15-4199-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.039