槲皮素對結腸癌SW480細胞增殖及蛋白表達的影響

王　芬,熊　玲

(湖北醫藥學院附屬人民醫院消化內科,湖北 十堰 442000)

槲皮素對結腸癌SW480細胞增殖及蛋白表達的影響

王芬,熊玲※

(湖北醫藥學院附屬人民醫院消化內科,湖北 十堰 442000)

隨著現代生活壓力的增大、飲食結構和習慣的改變，結腸癌發病率正呈逐年增高的趨勢，盡管目前在該病的診斷和治療方面都有不同程度的進展，但總體來說，患者的生存率及生活質量并無根本改觀[1-2]。化療藥物是一把“雙刃劍”，在抑制癌細胞的同時，其不良反應亦會明顯出現，且臨床發現結腸癌患者多數對化療藥物不敏感，治療效果差，預后不理想[3]。因此，探索靈敏度高、不良反應小、新劑型的抗結腸癌藥物已成為該領域的熱門課題[4]。基于天然產物的抗腫瘤藥物研發，近年來一直是抗腫瘤藥物研發的熱點，槲皮素逐漸進入人們的視野。研究表明，槲皮素有明顯的抑制腫瘤細胞生長的作用[5]。槲皮素廣泛存在于自然界，如水果、蔬菜、谷類作物中，是天然自由基清除劑[6]。前期有關研究證實，槲皮素具有止咳平喘、降壓降脂、抗病毒消炎和抗腫瘤等作用[7]。本研究通過觀察槲皮素對結腸癌 SW480細胞體外增殖及相關蛋白表達的影響，深入開展槲皮素抗腫瘤活性的物質基礎及其分子機制研究，旨在為槲皮素抗結腸癌的臨床應用提供理論依據，從而探討其抗癌機制。

1材料與方法

1.1主要實驗材料人結腸癌細胞株 SW480，購于百恩維生物科技有限公司，規格C0021。槲皮素、二甲基亞砜、兔抗人抗體Ki67、鼠抗人抗體均購于華拓生物科技有限公司。Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)培養基及牛血清均購自 Sigma 公司。細胞增殖、細胞毒性檢測試劑盒(CCK-8)購于上海翊圣生物科技有限公司，批號：CD0028179。

1.2方法

1.2.1細胞培養將人結腸癌SW480細胞培養于DMEM培養液中，并將細胞培養條件設定在37 ℃，5%二氧化碳，每隔3日用含有0.25% 乙二胺四乙酸的胰酶進行消化(1∶3傳代)。收集生長穩定、處于對數生長期的腫瘤細胞(細胞濃度1×108個/L)。將不同濃度的槲皮素(終濃度分別為 10、20、40、80、160 μmol/L) 加入相對應各組細胞干預，另設未進行槲皮素干預的陰性對照組，記錄各檢測指標。

1.2.2重組基膜侵襲實驗根據林增海等[5]重組基膜實驗法改良，將DMEM(不含血清)與 Matrigel 以5∶1的配置比例制成R溶液，每孔注入50 μL R溶液，在37 ℃培養箱中放置1 h即得到人工重組基膜。將20% FBS 培養基加入Transwell 小室的下室。取經槲皮素干預的腫瘤細胞將其細胞濃度調整為 1×108個/L，按照每孔100 μL量加到 Transwell 上室中，放入37 ℃、5%二氧化碳的培養箱內培育15 h后，除去Transwell 小室上室中的液體，取出聚碳酸酯濾膜，擦盡膜上剩余液體及殘余腫瘤細胞。用甲醇固定1 min，蘇木精-伊紅染色，200×顯微鏡下統計穿過聚碳酸酯膜的細胞數。每膜計數隨機選取 5 個不同視野 (上、下、左、右、中)。

1.2.3細胞運動能力測定該測定的實驗步驟與細胞侵襲能力實驗步驟相同，除了聚碳酸酯膜內表面不加用Matrigel。

1.2.4細胞增殖抑制率前期已成功培育出處于對數生長期的結腸癌細胞，取該細胞制成濃度為1×108/L的細胞混懸液，以100 μL/孔的標準注入于96孔板，培養箱孵育條件：37 ℃、5%二氧化碳，在該條件下將細胞孵育24 h后在孔中依次加入濃度分別為10、20、40、80、160 μmol/L的槲皮素并作用48 h，每個濃度需設3個對應孔。將等量的二甲基亞砜設為陰性對照組，并以空白孔調零，經槲皮素干預充分后，每孔加入13 μL CCK-8，待培養3 h后記錄吸光度(optical delnsity，OD)值，統計數據并進行分析。細胞增殖抑制率(%)=(1-槲皮素組OD值/陰性對照組OD值)×100%，觀察各組細胞的生長抑制情況。

1.2.5Ki67、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達運用紫外分光光度法測得各組總蛋白濃度，加熱變性后進行凝膠電泳，轉至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉作用2.5 h后，加兔抗人Ki67及鼠抗人PCNA一抗，在4 ℃條件下經過24 h后加1∶1000稀釋的HRP 標記的鼠抗兔及鼠抗羊二抗，室溫孵育0.5 h，PBS清洗3次超敏化學發光底物顯影。

2結果

2.1槲皮素對SW480細胞侵襲、運動能力的的影響在經濃度為10～160 μmol/L的槲皮素作用72 h后，SW480 細胞體外侵襲能力顯著降低，運動能力明顯下降，并隨藥物濃度的增加而更明顯。與對照組相比，在槲皮素的質量濃度為40～160 μmol/L 時，它對SW480細胞體外侵襲力及運動能力的差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

槲皮素濃度(mg/L)侵襲率運動穿膜率0100.00100.001070.88±11.2374.04±9.062063.78±8.9765.35±8.134058.33±6.58a60.46±4.08a8053.67±10.02a56.81±6.59a16050.13±7.55a53.69±4.57aF16.43743.213P<0.01<0.01

a與空白對照組(0 mg/L)比較，P<0.05

2.2槲皮素作用于SW480細胞體外增殖抑制的統計分析人結腸癌SW480細胞經不同濃度槲皮素干預72 h后，各組OD值經方差分析顯示10～160 mg/L濃度組與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且當槲皮素濃度為160 μmol/L 時，其干預可使SW480細胞增殖抑制率達到最大化，見表2。

槲皮素濃度(mg/L)OD450增殖抑制率(%)01.253±0.1400101.189±0.097a4.10±1.2a200.985±0.036a13.9±1.5a400.632±0.012a38.8±2.2a800.583±0.035a41.5±2.6a1600.520±0.021a45.3±2.6aF54.6299.874P<0.01<0.01

OD ：吸光度；a與空白對照組(0 mg/L)比較，P<0.05

2.3槲皮素對SW480細胞Ki67和PCNA表達的影響在槲皮素濃度為160 μmol/L時，隨著槲皮素干預時間的延長，Ki67和PCNA的表達呈下降趨勢，其蛋白表達程度在72 h 時達到最低，見圖1。

圖1　槲皮素干預SW480細胞Ki67、增殖細胞核抗原(PCNA)表達情況

3討論

從20世紀70 年代至今結腸癌的發病率為(28～37)/萬[8]，平均發生率以4.2%的增長率逐年增加[9]，雖然近年來在該病的診斷和治療方面均有不同程度的進展，但目前仍未找到有效的治療方法[10-11]。從天然植物中尋找有效的抗癌藥物是國內外臨床及科研工作者的研究熱點，因其具有多靶作用點、不良反應小等諸多優勢，目前已成為研究抗腫瘤藥物的熱門課題[12]。

槲皮素是天然存在的一種黃酮類化合物，它的作用廣泛，既往研究發現槲皮素具有清除自由基、抗癌、降壓、降脂、擴冠抗心律失常、抗血小板聚集等多種藥物作用，對人類腫瘤、衰老、感染、心血管疾病的治療和預防具有重要意義[13]。在抗腫瘤方面國內外的相關研究在白血病、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和膠質瘤等方面較多[14]，已知是有效抗癌劑之一，只要達到合適的藥物濃度，槲皮素便可直接阻滯腫瘤細胞的增殖[15]。因此，目前在腫瘤的化學預防和治療作用研究中，槲皮素日益受到人們關注，已然成為抗癌新寵[16]。Tan等[17]發現，槲皮素與重金屬螯合后的合成劑能夠嵌入腫瘤細胞染色體中，使細胞核皺縮引起細胞凋亡，從而達到抗癌效果。Zhou等[18]發現，槲皮素與銅螯合后能與腫瘤細胞DNA形成相互鍵合，破壞腫瘤細胞的異常增殖，抑制腫瘤細胞的惡性生長。Ferrer等[19]發現槲皮素釩具有抗骨腫瘤的作用。槲皮素抗腫瘤的確切療效顯示出十分重要的研究及應用價值，且不良反應小，已公認是頗具前景的抗癌藥物及癌腫放化療輔助用藥，深入研究其作用機制對臨床治療機藥物研發具有極其重要的意義。

從本研究結果可看出，槲皮素在體外的細胞毒作用能抑制結腸癌 SW480 細胞體外增殖，在一定范圍內其毒性作用隨劑量的增大而抑制增強，呈現正比量效關系。且在槲皮素用藥干預后腫瘤細胞的侵襲能力和運動能力具呈下降趨勢，說明槲皮素不僅能通過誘導細胞凋亡、加速細胞分化達到抑制細胞增殖的目的，還能影響腫瘤細胞體外侵襲力及運動活性，進而從多方面發揮抗腫瘤的作用，此外，在SW480增殖相關蛋白Ki67和PCNA的表達中發現，在濃度為160 μmol/L槲皮素干預可使SW480細胞增殖抑制率達到最大化，故取用該濃度干預SW480細胞，采用 Western blot 檢測蛋白Ki67和PCNA的表達情況。結果顯示，槲皮素可使SW480細胞內增殖相關蛋白Ki67和PCNA的表達下降，且在同等濃度下與時間呈正比關系。

總之，槲皮素對結腸癌SW480細胞體外異常增殖具有明顯的抑制作用，能影響該腫瘤細胞相關增殖蛋白的表達，它的廣泛藥用價值值得進一步研究，其抗腫瘤作用可能成為結腸癌藥物研究的新導向，具有廣闊的應用前景和開發價值。

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繼發癥繼發癥(Secondary disease)也稱續發癥，是指與原發病有明確的因果關系。在原發病的發生、發展過程中，由于機體的統一性、臟器間的相關性、病情擴展、免疫復合物-變態反應以及內環境失衡而累及其他臟器，必將發生密切的因果關系。例如：慢性支氣管炎-阻塞性肺氣腫-肺心病。又，繼發癥除原發病可出現，其他兼癥也能發生。

————劉桂蕊

摘要：目的研究槲皮素對 SW480 結腸癌細胞生長增殖及蛋白表達的影響。方法體外培養人結腸癌SW480 細胞后，采用人工重組基膜技術監測槲皮素對腫瘤細胞體外侵襲能力和運動活性的作用。將培養成功的細胞分為空白組和其余5個不同濃度(10、20、40、80、160 mg/L)的槲皮素作用組，觀察干預結果，檢測人結腸癌 SW480 細胞的增殖抑制率，選擇最佳作用濃度；并通過免疫印跡法檢測人結腸癌SW480內增殖細胞核抗原(PCNA)、Ki67的表達情況。結果結腸癌 SW480 細胞經槲皮素處理后，體外侵襲、運動能力呈劑量依賴性下降(P< 0.05)；槲皮素能顯著抑制結腸癌SW480細胞的增殖，濃度為10、20、40、80、160 μmol/L的槲皮素作用于結腸癌 SW480 細胞的增殖抑制率分別為(4.1±1.2)%、(13.9±1.5)%、(38.8±2.2)%、(41.5±2.6)%、(45.3±2.6)%，與空白組對照相比差異有統計學意義(P<0.05)；干預的結腸癌SW480 細胞內 Ki67和PCNA的表達均呈下調表現(P<0.05)。結論槲皮素可呈濃度和時間依賴性地抑制結腸癌SW480細胞的增殖，對人結腸癌 SW480 細胞的生長有抑制作用，并能誘導其凋亡。

關鍵詞：結腸癌；槲皮素；SW480；蛋白表達

Influence of Quercetin on the Proliferation and Protein Expression of SW480 Colon Cancer CellWANGFen,XIONGLing. (DepartmentofGastroenterology,ShiyanPeople′sHospitalAffiliatedtoHubeiMedicalCollege,Shiyan442000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the influence of quercetin on the proliferation and protein expression SW480 colon cancer cell.MethodsHuman SW480 colon cancer cells were cultured in vitro,then artificial recombination of the basement membrane was adopted to observe quercetin effect on cell invasion and motor activity.The successfully cultured cells were divided into blank group and the rest into five quercetin groups of different concentrations of quercetin (10，20，40，80，160 mg/L)，then human colon cancer SW480 cells proliferation inhibition rates were tested,based on which the best concentration was cosen; Western blot method was used to detect the expression of cell nucleus antigen (PCNA and Ki67) in human SW480 colon cancer.ResultsAfter treatment by quercetin,the in vitro invasion,motor ability of SW480 colon cancer cells presented dose-dependent decline(P<0.05);different concentrations(10，20，40，80，160 μmol/L) of quercetin and its proliferation inhibition rates were (4.1±1.2)%,(13.9±1.5)%,(38.8±2.2)%,(41.5±2.6)%,(45.3±2.6)%,the differences from the blank control were statistically significant(P<0.05); the expression of Ki67 and PCNA in SW480 colon cancer cells after intervention showed down trend(P<0.05).ConclusionQuercetin can inhibit the proliferation of SW480 colon cancer cells in a concentration and time dependent way,which has inhibitory effect on the growth of human SW480 colon cancer cells,and can induce its apoptosis.

Key words:Colon cancer； Quercetin； SW480； Protein expression

收稿日期：2014-12-08修回日期：2015-04-14編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.16.046

中圖分類號:R979.1; Q279

文獻標識碼:A

文章編號：1006-2084(2015)16-3011-03