石榴花中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選研究

劉 慧，康保珊，趙文恩，劉杰超，張春嶺

(中國農業科學院鄭州果樹研究所，鄭州 450009)

餐后高血糖是2 型糖尿病的表現癥狀和主要危害因素。α-葡萄糖苷酶抑制劑能夠與小腸刷狀緣α-葡萄糖苷酶活性中心部位結合［1］，阻抑酶活性的發揮，阻止雙糖水解，從而有效控制餐后血糖的升高和糖尿病的加重［2］。此類藥物對1、2 型糖尿病均適用，也可以與其他口服降糖藥或胰島素聯合應用［3］。近年來，從天然產物中篩選α-葡萄糖酶抑制劑日益受到重視。

石榴花在印度傳統草藥中一直被用作抗糖尿病藥物［4，5］，前人的研究為明確石榴花的抗糖尿病機制建立了良好的基礎，但報道多集中在研究某一特定物質或提取物的降糖活性，并未對石榴花中α-葡萄糖苷酶抑制劑進行系統全面地篩選，其真正的活性部位很有可能被遺漏或排除，阻礙了石榴花作為抗糖尿病藥物的應用。本研究目的在于利用α-葡萄糖苷酶的體外生物學活性檢測技術，篩選、確定石榴花中抑制α-葡萄糖苷酶的有效活性部位，為開發新型的天然抗糖尿病保健品提供一定的理論及技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴花于2014 年6 月采摘于中國農業科學院鄭州果樹研究所，采后陰干，粉碎備用。4-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷(pNPG) (BIO Basic INC.)，α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20，100U，日本和光純藥工業株式會社);AB-8 大孔樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司)。其余試劑為分析純。

電熱恒溫水浴鍋(DK-98-ⅡA，天津市泰斯特儀器有限公司);旋轉蒸發儀(RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠);高速冷凍離心機(J-25，Backman CoulterTM);分光光度計(722S，上海精密科學儀器有限公司分析儀器總廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶活性抑制率體外檢測模型

參考Maria D.P.T.Gunawan-Puteri 等的方法［6］，采用2 mL 反應體系如表1 所示。將5 mmol/L 的pNPG(pH 6.8，0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制)、0.1 mol/L pH 6.8 的磷酸緩沖液、樣品提取液依次加入到試管中，于37 ℃水浴保溫15 min。然后加入濃度為5 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液(用pH 6.8 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制)啟動反應，37 ℃水浴反應1 h。反應結束時，加入4% 的Na2CO3溶液以終止反應，分別測定400 nm 波長下的吸光值A，以(1)式計算酶抑制率y (%)。

表1 α-葡萄糖苷酶抑制率測定反應體系

1.2.2 石榴花中α-葡萄糖苷酶抑制劑提取溶劑的篩選

準確稱取2.0g 干燥石榴花瓣粉末，分別加入40mL水、乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、石油醚30℃超聲提取30min，過濾，重復2 次，合并濾液，濃縮定容至100mL，分別取200μL 提取液依據1.2.1 方法測定其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。同時，考察不同pH 值的水溶液體系對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.2.3 石榴花水提取液的分離及α-葡萄糖苷酶抑制活

性追蹤 在石榴花水提液(pH 8.0)分離的各個階段(圖1)，實時追蹤各分離部位的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，逐步篩選高抑制率的活性部位。

圖1 石榴花水提液分離流程

1.2.4 石榴花中活性物質對α-葡萄糖苷酶的抑制效果

取等量石榴花干燥粉末，分別采用何毓敏［7］、高英［8］、薩提瓦爾地［9］、熱依木古麗·阿布都拉［10］、周本宏［11］等的方法提取石榴花中皂甙、多糖、類黃酮、多酚、鞣質，將提取液濃縮、干燥成粉后，將對應粗提物配制成一定的濃度溶液，測定其對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取液的α-葡萄糖苷酶活性抑制率

從圖2 可以看出，對于不同極性的提取溶劑，水提取物的總抑制率最高，達到55.82%。同時，考察不同pH 值水溶液體系的α-葡萄糖苷酶抑制活性，結果表明，弱堿性提取液的抑制活性高于酸性提取液，抑制率最高的提前溶劑為pH 8.0 的水溶液。結果表明石榴花中對α-葡萄糖苷酶活性抑制效果較好的成分應該為極性較大的水溶性物質，可能包括糖類、鞣質、氨基酸、蛋白質、有機酸鹽、生物堿鹽及甙類等。堿性環境可增加有機酸、黃酮、蒽醌、內酯、香豆素以及酚類成分的溶出。

2.2 石榴花水提取液不同溶劑萃取部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性

石榴花水提取液先后經乙醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，各萃取部分的總抑制率及半抑制濃度(IC50)。從圖3 可以看出，水溶液不同極性萃取部分抑制率最高的為正丁醇萃取相，總抑制率高達94.83%，半抑制濃度為3.57 mg/mL，正丁醇相對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用明顯高于乙醚相和乙酸乙酯相，表明活性因子為極性較大的物質。

水提取液離心得沉淀①，經分步萃取后的水相加丙酮分離為上清液①和沉淀②，正丁醇相萃取后加丙酮的上清液②以及得到的沉淀③，分別經旋蒸、冷凍干燥等方式制成干燥粉末，加水溶解配制成不同濃度，以粗樣品的質量濃度(mg/mL)為橫坐標，酶抑制率(%)為縱坐標作圖，在濃度/抑制率曲線的線性范圍內計算相應的IC50，結果如圖4 及表2 所示。表2 結果表明，沉淀②的IC50最小，表明該部分的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力最高。水提取物經正丁醇萃取結果表明，沉淀②的IC50最小，表明該部分的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力最高。水提取物經正丁醇萃取后，加入丙酮產生的沉淀主要成分為皂甙類［7］。皂甙是一類具有多種生理功效的生物活性物質，具有調節血脂、血壓，降低血糖，抗氧化，抑制血栓形成等活性作用。近年來皂甙的降血糖作用的研究進展迅速，多種中草藥皂甙［12］、苦瓜皂甙［13］、大豆皂甙［14］、玉米須皂甙［15］、癩葡萄皂甙［16］等都已證實具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制效果和降血糖的功效，但石榴花中皂甙類物質抗糖尿病活性的研究未見報道。

圖2 不同溶劑提取液的α-葡萄糖苷酶活性抑制率

圖4 石榴花水提液分離不同部位的濃度/抑制率曲線

表2 石榴花水提液分離不同部位的濃度/抑制率線性方程及IC50結果

2.3 正丁醇相上清液②及沉淀③經大孔樹脂分離各部位的酶抑制活性

將活性較高的正丁醇相濃縮后加等體積丙酮，靜置沉淀，離心后分離得到上清液②及沉淀部分③，分別干燥后，用水溶解至適當的濃度，用AB-8 大孔樹脂吸附，經不同濃度乙醇洗脫，得到4 個部分，洗脫液旋蒸定容至相同體積，不同洗脫部位的α-葡萄糖苷酶活性抑制率如表3 所示。其中上清液②的70%、95%乙醇部分，沉淀③的95%乙醇部分經測定沒有活性。從結果可以看出，活性部位集中在50%和70%乙醇洗脫部分。

表3 上清液②及沉淀③經大孔樹脂洗脫的各部位對α-葡萄糖苷酶的抑制率

大孔樹脂AB-8 已經被廣泛應用于生物活性物質的分離和純化，是分離植物中活性成分的一種有效手段。大量的研究表明，利用AB-8 大孔樹脂進行皂甙純化，有效部位多集中在40%～80%的乙醇部位［17-19］。從表3結果可以看出，沉淀③經大孔樹脂吸附純化后，70%乙醇洗脫的部位活性最高，其次為50%乙醇部位，這一結果在一定程度上符合前人在皂甙類大孔樹脂吸附純化的研究內容，更進一步加強了石榴花中皂甙類是關鍵的α-葡萄糖苷酶活性抑制因子的可能性。

2.4 石榴花中幾種活性成分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

石榴花中抗糖尿病活性物質主要有多酚類、黃酮類、三萜類［20］。結合本試驗2.1-2.3 結論，同時參考有關文獻，選擇石榴花中幾種主要的水溶性活性成分，考察對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。以抑制劑粗提物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，在線性濃度范圍內作抑制率曲線并計算IC50，結果如圖5 所示。

圖5 不同活性物質對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率曲線及IC50

從圖5 可以看出，石榴花皂甙、多糖、生物堿、類黃酮、多酚的粗提液對α-葡萄糖苷酶均有一定抑制作用，在一定的濃度范圍之內呈線性關系。IC50從小到大依次為皂甙＜多糖＜鞣質＜類黃酮＜多酚。其中，多酚和類黃酮粗提物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用最弱，IC50分別為18.855、14.864 mg/mL，當粗提物質量濃度達到25.0 mg/mL 時，抑制率為70.59% 和77.87%。而皂甙的抑制作用最強，皂甙粗提物的IC50為3.853 mg/mL，粗提物的質量濃度為5.0 mg/mL 時，對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率達到78.39%。這一結果可能與各種活性成分提取方法以及粗提物中的有效成分含量有關，皂甙類物質提取后經過了初步純化，而多酚和類黃酮物質均為溶劑提取的混合物質，有效成分含量較低。

3 結論

石榴花一直被用作治療糖尿病的傳統中藥，本研究篩選出石榴花中抑制α-葡萄糖苷酶活性的高效提取溶劑為pH 8.0 的水提取液。在此基礎上對石榴花水提取液進一步的分離，以體外α-葡萄糖苷酶活性抑制率為跟蹤目標，找出活性最高的部位為正丁醇萃取相經丙酮沉淀部位。該部位經AB-8 大孔樹脂吸附，50%和70%乙醇洗脫部位的酶抑制活性較高。初步推斷石榴花中抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質為皂甙類。至于其活性成分的具體化學成分與結構，尚待深入研究。

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