橙皮素抗apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化作用及其機制

朱小琴，華曉芳，李磊，李小燕，張軍

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論著·基礎

橙皮素抗apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化作用及其機制

朱小琴，華曉芳，李磊，李小燕，張軍

目的 探討橙皮素抗apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化作用及其機制。方法 40只8周齡apoE-/-小鼠隨機分為4組，即普通飲食組(NC)、動脈粥樣硬化高脂飲食組(WD)、橙皮素高劑量(100mg/kg)組(H-HES)、橙皮素低劑量(50mg/kg)組(L-HES)，各10只。采用灌胃方式給予橙皮素，根據每只小鼠體質量給予不同的劑量，12周后處死小鼠前眶靜脈采血，全自動生化分析儀檢測血清三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇濃度，并采用ELISA試劑盒檢測apoE-/-小鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP- 1)的濃度，麻醉小鼠后左心室灌注多聚甲醛固定，主動脈樹油紅O染色觀察斑塊百分比，同時取材主動脈竇采用免疫熒光技術觀察斑塊巨噬細胞的浸潤情況。結果 與NC組比較，WD組、H-HES組及L-HES組apoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C濃度顯著升高，HDL-C顯著降低(P<0.05)，且H-HES及L-HES組TC、TG、LDL-C的水平顯著低于WD組 (P<0.05)。高脂高膽固醇飼料喂養12 周后，WD組的主動脈樹動脈粥樣硬化病變非常顯著，其主動脈樹的AS斑塊面積百分比為(0.143 0±0.060 4)，而H-HES組、L-HES組的主動脈樹AS的面積百分比分別為(0.040 4±0.017 5)、(0.025 2±0.019 5)，與WD組相比，H-HES組、L-HES組主動脈樹AS病變顯著減輕，差異有統計學意義 (P<0.05)。WD組的主動脈竇動脈粥樣硬化斑塊部位巨噬細胞浸潤增加，經過橙皮素12 周治療后，H-HES和L-HES組主動脈竇斑塊部位CD68巨噬細胞浸潤減少(P<0.05)。WD組apoE-/-小鼠血清MCP-1 和TNF-α的濃度分別為 (807.33±122.46)、(9.87±1.75)μg/L高于H-HES及L-HES組的(365.83±66.31)、(6.34±0.65)μg/L及 (405.74±46.21)、(9.48±0.82)μg/L，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 橙皮素有明顯的調脂降血脂作用，同時具有抗動脈粥樣硬化效果，其主要通過抗炎發揮藥理作用。

橙皮素；動脈粥樣硬化；apoE-/-小鼠；巨噬細胞

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.02.020

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種在發病過程中伴有炎性反應的慢性病變[1]，動脈粥樣硬化首先累及動脈內膜，先后有多種病變共存，并伴有動脈中層的退變，繼發病變尚有斑塊內出血、斑塊破裂及局部血栓形成[2～4]。在多種動脈粥樣硬化的發病機制中，目前較為認可的是炎性損傷學說，炎性反應機制在AS的發生發展過程中發揮重要作用,多種免疫細胞和免疫分子相互作用、相互影響,促進了AS的發生發展。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, oxLDL)在AS發生過程中發揮重要作用[5]，oxLDL是低密度脂蛋白(LDL)在體內發生氧化修飾形成的脂蛋白,此反應與體內高氧化應激狀態密切相關，LDL氧化修飾后,其理化性質和生物學特性發生改變,可以通過細胞毒性及化學趨化作用促進血管平滑肌增殖，加速泡沫細胞形成，進而影響纖溶和凝血等機制促進AS的發展[6]。

近年研究證明橙皮素(hesperetin)具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等多種藥理學作用[7]，可以減少在TNF-α作用下單核細胞對血管內皮細胞的黏附，進而減輕炎性反應[8]，同時也可使巨噬細胞脂質轉運體腺苷三磷酸結合轉運體A1(ABCA1)表達增加，減少泡沫細胞的生成[9]。研究證明橙皮素可以有效改善高脂誘導倉鼠代謝綜合征的血脂水平，也可減輕機體的高氧化應激狀態[10]，同時研究證實橙皮素可以通過抑制PLC-γ2磷酸化，發揮抗血小板聚集作用進而減少血栓的形成[11，12]。本研究旨在觀察橙皮素對apoE-/-小鼠高脂血癥及動脈粥樣硬化的治療效果，以期為橙皮素預防動脈粥樣硬化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 橙皮素：上海融禾醫藥科技發展有限公司生產，批號520332；光學顯微鏡： Olympus公司，型號Olympus BX51；石蠟包埋機及石蠟切片機：德國Leica公司；抗體CD68：購自CST公司，貨號50655；Alexa 488山羊抗兔IgG熒光二抗：購自美國Invitrogen生物技術有限公司，貨號MP02764。

1.2 實驗動物 8周齡雄性apoE-/-小鼠40只，體質量(20±2)g，購自北京大學實驗動物中心，隨機分為4組，即普通飲食組(NC)、動脈粥樣硬化高脂飲食組(WD)、橙皮素高劑量(100 mg/kg)組(H-HES)、橙皮素低劑量(50 mg/kg)組(L-HES)，每組10只，所有動物均飼養于SPF級屏障環境，自由飲水，SPF級營養小鼠飼料。

1.3 實驗方法 使用PBS溶解橙皮素配置濃度為100 mg/ml，每天8∶00給予1次灌胃，根據每只小鼠體質量給予不同的劑量，連續灌胃12周后處死，處死前禁食12 h，不禁水。

1.4 主動脈樹斑塊定量分析 實驗小鼠經異戊巴比妥鈉麻醉后，固定于取材板，從左心室緩慢灌流4%多聚甲醛，然后分離主動脈弓和胸主動脈，縱向剖開管腔后進行油紅O染色，蠟板固定、拍照，使用Image-pro plus6.0圖像處理軟件統計小鼠主動脈樹油紅O染色斑塊面積及總面積，并計算斑塊面積占總面積百分比。

1.5 主動脈斑塊部位炎性細胞浸潤定量分析 實驗小鼠處死后從左心室先灌流PBS后灌注4%多聚甲醛，分離主動脈弓升主動脈部分，取出后放于4%多聚甲醛固定1周，石蠟包埋切片，烘箱65℃烘片30 min溫檸檬酸修復10 min，4℃一抗CD68孵育組織12 h，加入Alexa 488山羊抗兔IgG熒光二抗標記CD68陽性巨噬細胞，熒光顯微鏡拍照后使用Image-pro plus 6.0圖像處理軟件統計結果。

1.6 血脂測定 取材前禁食12 h 后，小鼠乙醚麻醉，于眶靜脈采血0.3 ml，4 000 r/min離心20 min，取40 μl血上清于全自動生化分析儀，檢測血清三酰甘油 (TG)、總膽固醇 (TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度。

1.7 血清腫瘤壞死因子(TNF-α)和單核細胞趨化蛋白(MCP-1)表達 小鼠血清TNF-α和MCP-1按ELISA 試劑盒說明書操作測定表達量，以A450值表示結果，根據說明書繪制標準曲線，并根據標準曲線查找其對應的濃度范圍，每組樣品點3 孔。

1.8 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均值±標準差表示，多組間均數兩兩比較采用q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血脂測定結果 與NC組比較，WD組apoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C濃度顯著升高(P<0.05)，H-HES和L-HES組apoE-/-小鼠血清中的TC、TG、LDL-C的水平顯著低于WD組(P<0.05)，表明橙皮素具有降低TC、TG、LDL-C的水平。與NC、WD組比較，L-HES、H-HES組升高。見圖1。

注：與NC組比較，aP<0.05；與WD組比較，bP<0.05

2.2 主動脈樹動脈粥樣斑塊結果測定 經過12 周的高脂高膽固醇飼料喂養后，WD組的主動脈樹動脈粥樣硬化病變非常顯著(圖2，見封3)，其主動脈樹的AS斑塊面積百分比為(0.1430±0.0604)；而H-HES組、L-HES組的主動脈樹AS的面積百分比分別為(0.0404±0.0175)和(0.0252±0.0195)(圖3)，與WD組相比，NC組、H-HES組、L-HES組主動脈樹AS病變顯著減輕，差異有統計學意義 (P< 0.05)。

圖3 主動脈樹動脈粥樣硬化斑塊百分比

2.3 主動脈竇斑塊部位巨噬細胞浸潤情況 高脂高膽固醇飼料喂養后，WD組的主動脈竇動脈粥樣硬化斑塊部位巨噬細胞浸潤增加，經過橙皮素12 周治療后，H-HES和L-HES組主動脈竇斑塊部位CD68巨噬細胞浸潤減少(圖4，見封3)，各組間比較差異有統計學意義(P<0.05)(見圖5)。

注：與NC組比較，aP<0.05；與WD組比較，bP<0.05

2.4MCP-1和TNF-α表達測定NC組MCP、TNF-α濃度分別為(606.54±35.22)μg/L、(6.38±0.74)μg/L，WD組apoE-/-小鼠血清MCP-1 和TNF-α的濃度分別為 (807.33±122.46)μg/L、(9.87±1.75)μg/L，高于H-HES及L-HES組的(365.83±66.31)μg/L、(6.34±0.65)μg/L及 (405.74±46.21)μg/L、(9.48±0.82)μg/L(P< 0.05)。

3 討 論

大量的研究資料表明，血脂水平異常，特別是膽固醇和三酰甘油水平升高與AS的發生發展密切相關。高脂血癥長期作用下可直接引起內皮細胞損傷，使內皮細胞的通透性增加，其還參與LDL的氧化修飾，使其成為oxLDL，LDL氧化修飾后,其理化性質和生物學特性發生改變,可以通過細胞毒性及化學趨化作用促進血管平滑肌增殖，加速泡沫細胞形成，進而影響纖溶和凝血等機制促進AS的發展。采用基因敲除(基因打靶)技術建成的apoE基因敲除小鼠動物模型，已成為目前在AS研究領域中應用最多的基因工程動物。中藥提取物對apoE基因敲除小鼠AS的干預在國內尚處于起步階段，橙皮素抗apoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的研究在國內外還未見報道。

研究證實，橙皮素具有減輕氧化應激同時通過激活ASK1/JNK信號通路發揮抗乳腺癌作用，其具有多種藥理作用[13，14]。但橙皮素對在體小鼠動脈粥樣硬化的治療作用國內外報道尚未明確，以上文獻報道證明橙皮素可以減輕機體的炎性反應狀態及減少炎性因子的釋放，為橙皮素治療動脈粥樣硬化提供了一定的理論線索。

本結果證明橙皮素可以有效改善apoE-/-小鼠的血脂異常，降低小鼠血清中的TC、TG、LDL-C，同時可以提高小鼠體內的HDL-C的濃度。在動脈粥樣硬化的發生機制中，巨噬細胞發揮了重要作用，減少巨噬細胞在斑塊部位浸潤，可以使斑塊部位的泡沫細胞形成減少[15]。本研究通過免疫熒光染色標記CD68巨噬細胞，顯示橙皮素會明顯減少巨噬細胞在主動脈竇斑塊部位的浸潤，采用ELISA法檢測血清中的MCP-1、TNF-α，結果表明經過12周的治療，可以明顯減低apoE-/-小鼠MCP-1及TNF-α表達。

綜上所述，橙皮素有效減輕了apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化，并有效改善了小鼠的血脂異常；橙皮素可有效抑制巨噬細胞在斑塊部位的浸潤。因此，我們認為橙皮素能減輕或延緩動脈粥樣硬化的進展，抑制炎性反應，這些保護效果可能與橙皮素抑制巨噬細胞浸潤及減少MCP-1及TNF-α炎性因子的分泌相關。

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Effect of hesperetin in anti apoE-/- mice atherosclerosis and its mechanism

ZHUXiaoqin*,HUAXiaofang,LILei,LIXiaoyan,ZHANGJun.

*DepartmentofCardiacvascular,CentralHospitalofEnshiAutonomousPrefecture,Enshi445000,China

Objective To investigate the effect of hesperetin in anti apoE-/- mice atherosclerosis and its mechanism.Methods Forty eight-week-old apoE- / -mice were randomly divided into four groups, normal diet group (NC), atherosclerosis high-fat diet group (WD), hesperetin high dose (100 mg/kg) group (H-HES), hesperetin low dose (50 mg/kg) group (L-HES), each group with 10 mice, by using of orally administered hesperetin, according to each mouse body weight to give different dose, the mice were sacrificed after 12 weeks and orbital venous blood were sampled, automatic biochemical analyzer was used to detect the serum triglyceride, total cholesterol, low-density lipoprotein cholesterol and high-density lipoprotein cholesterol levels, and using ELISA kit to detect the serum tumor necrosis factor (TNF-α) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)'s concentration in these apoE -/- mice. After anesthetized, mice' left ventricle were perfused with paraformaldehyde, aortic tree oil red O staining were used to observe the percentage of plaque, while the aortic sinus were sampled and by using immunofluorescence to observe the infiltration of macrophages in the plaque.Results Compared with NC, WD group, H-HES and L-HES group's serum TC, TG, LDL-C concentrations were significantly increased, HDL-C significantly decreased (P<0.05),H-HESandL-HESgroup'sTC,TG,LDL-ClevelwaslowerthanthatinWDgroup(P<0.05).Highfatandhighcholesteroldietfor12weeks,thelesionsofaorticatherosclerosisingroupWDwasverysignificant,ASplaqueareapercentageoftheaortawas(0.143 0±0.060 4);andtheareapercentageinH-HESgroupandL-HESgroupwere(0.040 4±0.017 5)and(0.025 2±0.019 5),comparedwiththeWDgroup,H-HESgroupandL-HESgroup'saorticASweresignificantlydecreased,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).MacrophagesinatheroscleroticlesionofaorticsinusingroupWDwasincreased,after12weeksofhesperetintreatment,theH-HESandL-HESgroup'saorticsinusplaque'sCD68macrophageinfiltrationweredecreased(P<0.05).WDgroup'sserumMCP-1andTNF-αconcentrationwere(807.33±122.46)and(9.87±1.75)μg/L,whichwerehigherthanH-HESandL-HESgroup's(365.83± 66.31)and(6.34± 0.65)μg/Land(405.74±46.21), (9.48±0.82)μg/L(P<0.05). Conclusion Hesperetin has significant effect on decreasing the blood lipid, also has anti atherosclerosis effect, mainly through its anti-inflammatory pharmacological effects．

Hesperetin;Atherosclerosis; ApoE- /-mice; Macrophage

445000 湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院內科心血管病中心(朱小琴、華曉芳)； 430060 武漢大學人民醫院 心內科(李磊、李小燕、張軍)

2014-09-29)