負載肺癌全抗原的自體樹突狀細胞誘導T細胞反應的體外研究

霍忠超，劉曉霞，王雪玲，陳劍華，蘇英

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負載肺癌全抗原的自體樹突狀細胞誘導T細胞反應的體外研究

霍忠超，劉曉霞，王雪玲，陳劍華，蘇英

目的 在體外研究負載肺癌全抗原的自體樹突狀細胞(DCs)誘導的T細胞增殖及細胞毒作用。方法 肺癌組織、正常肺組織和外周血新鮮標本均取自肺鱗狀細胞癌并行手術治療的7例患者，肺癌組織和正常肺組織制備為單細胞懸液。自外周血分離單核細胞并誘導DCs，尼龍毛柱法分離T細胞。凍融法制備自體肺癌細胞裂解液，并刺激DCs，制備負載自體肺癌全抗原的DCs。MTS法檢測負載肺癌全抗原的DCs對T細胞增殖的影響；流式細胞術測定DCs表型及負載肺癌全抗原的DCs對T細胞細胞毒作用的影響。結果 外周血單核細胞經GM-CSF、IL-4和TNF-α誘導培養后，在細胞膜上出現大量的樹突狀突起，表面分子CD14表達顯著降低(t=20.157，P<0.01)，CD1a、CD11c、CD80、CD83和HLA-DR表達明顯增加(t=8.927，3.042，14.311，18.537，5.612，P<0.05，P<0.01)，獲得負載肺癌全抗原的成熟DCs；其能刺激自體T細胞增殖，不同患者刺激指數不同為6.98～39.15(21.56±4.38)，而且DC/T比率越高，刺激指數越高，T細胞增殖反應能力越強(t=31.203，19.550，P<0.01)；負載肺癌細胞全抗原的DCs能誘導自體T細胞的細胞毒作用，且T細胞對自體腫瘤細胞的殺傷率為(56.52±2.75)%；對正常細胞的殺傷率平均為(5.31±1.37)%，明顯低于對自體腫瘤細胞殺傷率(t=16.429，P<0.01)。對K562細胞殺傷率為(9.71±2.46)%，明顯低于對自體腫瘤細胞殺傷率(t=25.010，P<0.01)。結論 負載肺癌全抗原的DCs能誘導肺癌患者自體T細胞增殖及細胞毒作用，且體外可有力的殺傷腫瘤細胞，而幾乎不殺傷正常細胞。

肺癌；全抗原；樹突狀細胞；自體T細胞；細胞毒作用

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.02.021

肺癌是人類最常見的癌癥，近年來其發病率和病死率增長迅速，也是嚴重威脅人類健康和生命的癌癥之一。肺癌的治療經過臨床工作者的不懈努力已得到迅速發展。免疫療法是腫瘤治療的新領域，其主要通過調節抗腫瘤的免疫反應來達到治療腫瘤的目的。有報道稱樹突狀細胞的免疫治療在肺癌的臨床應用中具有一定的有效性[1，2]，但尚缺乏有力的理論支持，且未見關于負載腫瘤抗原的DCs(表面表達腫瘤抗原肽的樹突狀細胞)對自體正常組織細胞的殺傷作用研究，故在本實驗中對此進行了研究，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑： RPMI1640培養基購自GIBCO公司；人重組GM-CSF、IL-4、TNF-α和IL-2購自R&D公司；AB血清由中心血站提供；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司。PE標記的小鼠抗人CD80、PE標記的小鼠抗人CD83、PE標記的小鼠抗人CD1a、PerCP標記的小鼠抗人HLA-DR、APC標記的小鼠抗人CD11c均購自B&D公司。

1.1.2 實驗標本： 腫瘤組織、正常組織和外周血均取自手術治療的7例肺鱗狀細胞癌患者。男4例，女3例，年齡48～65(59±6)歲。TNM分期均為III期，手術前未接受任何治療。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞懸液制備： 按照文獻[3]方法稍加改良在室溫且無菌的條件下進行。將手術中新鮮無菌采集的腫瘤組織和正常組織標本放在無菌細胞培養液中，迅速送往實驗室。用眼科剪去除結締組織、脂肪和壞死組織后，將組織標本剪為1～3 mm3的小塊，用組織培養液洗滌2次。切碎的組織放在盛有酶溶液5 ml的培養瓶中，在37℃、5%CO2條件下培養1 h，然后用連續密度離心法獲得單個細胞懸液。最后的細胞用細胞培養液洗2次，計數，然后凍存在液氮中。使用時，將細胞解凍并通過percoll梯度離心富集活細胞。NK細胞敏感的K562(人慢性粒細胞白血病細胞株，在免疫實驗中常用做靶細胞)用細胞培養液培養，作為T細胞細胞毒實驗中的靶細胞。

1.2.2 肺癌細胞裂解液制備： 取2×107個腫瘤細胞用完全培養液洗滌，在液氮中冷凍10 min ，37℃水浴解凍，反復4次獲得天然的裂解液。離心去除大分子成分(先2 000 g離心10 min，然后4℃13 000 g離心60 min)，過濾滅菌，蛋白成分用Cummassie藍蛋白分析，然后等量分裝后于-80℃保存。

1.2.3 負載肺癌全抗原DC制備： 用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，并用含10%AB血清的完全培養液懸浮，于培養瓶中37℃、5%CO2、飽和濕度貼壁培養2 h。吸取未貼壁細胞用尼龍毛柱法分離T淋巴細胞，備用。在培養瓶中加入含GM-CSF和IL-4的完全培養基，GM-CSF和IL-4的終濃度分別為1 000 U/ml和800 U/ml，隔天吸去2 ml培養基，加入3 ml新鮮的含細胞因子的培養基進行培養。第4天，在未成熟DC中加入腫瘤細胞裂解物，蛋白終濃度為50 μg/ml，孵育過夜。第5天，按體積比加入25%的TNF-α。第7天收集腫瘤抗原致敏的成熟DCs。

1.2.4 負載肺癌全抗原DC的表型測定： 收集1.2.3中第5、7天的部分細胞，用PBS洗滌2次，調整細胞濃度為1×106/ml，加入流式管，200 μl/管，加入熒光素標記的抗體，4℃孵育45 min，PBS洗滌2次，重懸細胞，流式細胞儀檢測。

1.2.5 T細胞增殖測定： 用30Gy γ射線照射負載肺癌全抗原的自體DCs，并將其作為刺激細胞，尼龍毛柱法富集的自體T細胞作為反應細胞，分為實驗組(刺激細胞與反應細胞比例分別為：1∶5、1∶10、1∶20)、PHA組(用2.5%PHA刺激的T細胞)、對照組(單純T細胞)，在96孔培養板中進行培養，加入含10%AB血清的完全培養基，終體積為200 μl，培養5 d，在結束培養前4 h，加入MTS，每個樣本均設3個復孔。培養結束，于490 nm檢測吸光度，并按下式計算刺激指數：刺激指數=實驗組OD/對照組OD

1.2.6 腫瘤特異性CTLs誘導： 用30Gy γ射線照射的負載肺癌全抗原的DCs，調整濃度為1×105/ml，與2.5×106/ml尼龍毛柱分離的自體T細胞，按1∶10的比例加入到24孔培養板中，用含10%AB血清的RPMI1640，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養19 d。每周以1∶20的比率用負載腫瘤細胞抗原的DCs刺激反應T細胞2次。每隔2 d加入新鮮的培養基和20 U/ml的人重組IL-2，后者在第2個刺激周期之后加入。第19天收集腫瘤抗原預先致敏的T細胞。

1.2.7 CTLs細胞毒作用測定： 解凍1.2.1中制備的單個肺癌腫瘤細胞和正常細胞并用percoll梯度離心法富集活細胞，活細胞達到80%～90%。用不含AB血清的培養基洗滌肺癌細胞、正常乳腺細胞和K562細胞2次，用緩沖液再次懸浮細胞，加入1 mmol/L的新鮮配制的PKH-26染液，在37℃條件下孵育60 min，每15 min搖晃1次。在室溫加入500 μl人AB血清孵育30 s停止標記反應，并用含10%人AB血清的PRMI1640洗滌2次。將PKH-26標記的靶細胞分別按1.2.6中誘導的抗原預先致敏T細胞以20∶1的比例加入到96孔培養板，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養3 h，終體積為200 μl。收集細胞，用PBS洗滌，用緩沖液懸浮，并立即在黑暗的環境中加入FITC標記Annexin V和PI在室溫孵育20 min，進行流式檢測。并將相同量未標記和PKH-26單獨標記的靶細胞分別作為對照組和最大標記組。用流式細胞儀進行三色流式細胞分析。用下列公式計算CTL的殺傷率：CTL殺傷率(%)=[實驗組(%)-對照組(%)]/[最大標記組(%)-對照組(%)]

2 結 果

2.1 負載肺癌全抗原DC形態及表型 通過在貼壁的單核細胞中加入GM-CSF和IL-4，培養3d后，出現了懸浮細胞，此后，懸浮細胞體積增大，數量增加。第5天，在負載肺癌全抗原的DCs中加入成熟誘導因子TNF-α，第7天，表現為松散聚集的細胞團或具有典型樹突狀形態的單個懸浮細胞，用倒置顯微鏡觀察，這些細胞表現出樹突狀細胞的典型形態，細胞膜表面有許多不規則突起。用臺盼藍鑒定DCs活力達到98%以上。見圖1。

流式細胞術顯示與未成熟樹突狀細胞相比，CD14表達減少(t=20.157，P<0.01)，代表為成熟DCs的表面標志CD1a、CD11c、CD80、CD83、HLA-DR表達增多(t=8.927，3.042,14.311,18.537,5.612，P<0.05，P<0.01)。見圖2。

圖1 培養7天的DCs形態(×400)

注：與未成熟DCs比較,aP<0.05，bP<0.01

2.2 負載肺癌全抗原的DCs對自體T細胞增殖能力的影響 自體T細胞經γ射線照射的負載肺癌全抗原的DCs刺激后，7例患者的T細胞在3種比例培養基中，均能發生增殖反應。刺激指數為6.98～39.15(21.56±4.38)。而且不同的DC∶T比率時的刺激指數有顯著性差異，DC∶T比率越高，刺激指數越高，T細胞增殖反應能力越強(t=31.203，19.550，P<0.01)。見圖3。

2.3 腫瘤特異性T細胞的細胞毒作用 自體T細胞經γ射線照射后的負載肺癌全抗原的DCs多次刺激后，誘導為抗原預先致敏的T細胞，將其與經PHK-26染色的肺癌細胞、正常肺組織細胞和K562細胞共培養后進行細胞毒性分析。T細胞對自體腫瘤細胞的殺傷率為(23.16±1.13)%～(80.44±5.35)%，平均為(56.52±2.75)%；對正常細胞的殺傷率為(1.2±0.32)%～(13.12±3.48)%，平均為(5.31±1.37)%；對K562細胞殺傷率平均為(9.71±2.46)%，明顯低于對自體腫瘤細胞的殺傷率(t=25.010，P<0.01)。明顯低于對自體腫瘤細胞的殺傷率(t=16.429，P<0.01)。見圖4。

3 討 論

樹突狀細胞是機體最有效的、能激活初始T細胞的抗原提呈細胞。樹突狀細胞來源于骨髓，定居于非淋巴組織，處于靜止或者未成熟狀態，他們能有效地捕獲和加工處理抗原，當受到抗原刺激后，樹突狀細胞會經歷成熟過程，表達MHC分子和共刺激分子并遷移至外周淋巴器官，此時抗原提呈能力增強，激活初始T細胞[4]。由于它們激活靜息T細胞的獨一無二的能力，因此樹突狀細胞在免疫治療中，特別是對惡性腫瘤的抗腫瘤免疫治療中，具有優先權。

注：A.每位患者平均刺激指數；B.不同DC∶T比率的平均刺激指數；與1∶20組比較，aP<0.01；與1∶10組比較，bP<0.01

圖3 負載肺癌全抗原的DCs對自體T細胞增殖能力的影響

注：與腫瘤細胞組比較,aP<0.01

由于用全部肺癌細胞裂解液去致敏DCs時，不僅腫瘤抗原可被DCs提呈，而且其中包含的自身抗原也可被提呈，因此，自身抗原的提呈是否會誘導自身免疫反應是不容忽視的問題。故本實驗同時觀察了負載自體腫瘤全抗原的樹突狀細胞對自體正常細胞的殺傷作用，這是其他學者所沒有研究的，本實驗結果發現被激活的T細胞對自身正常組織也有一定的殺傷作用，但遠遠低于對自體肺癌細胞的殺傷作用。

總之，我們發現負載肺癌全抗原的DCs能誘導肺癌患者T細胞介導的免疫反應，在體外有力地殺傷腫瘤細胞，而幾乎不殺傷正常細胞。本結果為臨床上進行腫瘤DC-CIK的免疫治療提供了有力的支持。

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In vitro study of T cell responses induced by lung cancer’s whole antigen pulsed with autologous dendritic cells

HUOZhongchao*,LIUXiaoxia,WANGXueling,CHENJianhua,SUYing.

*DepartmentofOncology,AffiliatedHospitalofHebeiUniversityofEngineering,Handan056002,ChinaCorrespondingauthor:WANGXueling,E-mail:wangxuelingcool@126.com

Objective To investigate the load cell lung cancer antigen autologous dendritic (DCs)-induced T cell proliferation and cytotoxicity in vitro.Methods Lung cancer tissue, normal lung tissue and peripheral blood of fresh specimens were taken from 7 patients with squamous cell carcinoma who were treated with operation, normal lung tissue and lung cancer were prepared for single cell suspension. From the peripheral blood, mononuclear cells isolated and induced DCs; nylon wool columns were used to isolate the T cells. Using frozen melt method to prepare the autologous lung cancer cell lysates liquid, and stimulate the DCs, preparation of loaded with autologous lung cancer antigen DCs. Using MTS method to detect DCs complete antigen load of lung cancer on T cell proliferation; flow cytometry determination of DCs phenotype and the effect of load DCs complete antigen of lung cancer on T cell cytotoxicity.Results Peripheral blood mononuclear cells through GM-CSF, IL-4 and TNF-α’s induce, a large number of dendritic protrusions, surface molecules CD14 expression was significantly lower (t=20.157,P<0.01),CD1a,CD11c,CD80,CD83andHLA-DRexpressionwassignificantlyincreased(t=8.927,t=3.042,t=14.311,t=18.537，t=5.612,P<0.05,P<0.01),matureDCswhichwasobtainfromwholeloadoflungcancerantigencanstimulateautologousTcellproliferation,differentpatientsrevealeddifferentstimulationindex: 6.98-39.15 (21.56±4.38),andthehighertheDC/Tratio,thehigherthestimulationindex,thestrongerofTcellsabilitytorespondtotheproliferation(t=31.203,t=19.550,P<0.01);DCsofloadlungcancercellwholeantigencaninducecytotoxicityofautologousTcells,andTcellstoautologoustumorcellkillingratewas(56.52 ± 2.75)%;normalcellaveragekillingratewas(5.31 ± 1.37)%,significantlylowerthanfortheautologoustumorcellkillingrate(t=16.429,P<0.01).ThekillingrateofK562cellwas(9.71±2.46)%,whichissignificantlylowerthanthekillingrateofautologoustumorcells(t=25.010,P<0.01). Conclusion Load lung cancer complete antigen’s DCs can induce lung cancer patients’ autologous T cell proliferation and cytotoxicity, and can effectively kill tumor cells in vitro, and normal cells were not killed.

Lung cancer; Whole antigen; Dendritic cells; Autologous T cells; Cytotoxicity

邯鄲市科學技術發展計劃項目(No.1123108079-5)

056002 邯鄲，河北工程大學臨床醫學院腫瘤科(霍忠超、蘇英)，河北工程大學臨床醫學院免疫教研室(劉曉霞、 王雪玲、陳劍華)

王雪玲，E-mail:wangxuelingcool@126.com

2014-09-05)