微RNA在乙型肝炎病毒感染不同時期表達譜的變化及其意義

秦海瑜，陳宇輝

(臨高縣人民醫院檢驗科，海南 臨高 571800)

?

微RNA在乙型肝炎病毒感染不同時期表達譜的變化及其意義

秦海瑜※，陳宇輝

(臨高縣人民醫院檢驗科，海南 臨高 571800)

摘要：目的探究微RNA(miRNA)在乙型肝炎病毒感染不同時期表達譜的變化及其意義。方法選取2012年3月至2014年1月于臨高縣人民醫院就診的乙型肝炎病毒(HBV)感染者200例，其中急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者和健康對照組各50例，提取外周血中單個核細胞后，分離信使RNA，采用RNA-DNA嵌合探針液態芯片技術檢測miR-20a、miR-21、miR-31、miR-145、miR-222、miR-191、miR-371、miR-223、miR-126的表達水平。結果不同時期HBV感染者外周血單個核細胞中miR-21、miR-31、miR-145、miR-222、miR-191、miR-371的表達水平比較，差異無統計學意義；miR-20a的表達水平隨HBV感染的發展而升高， miR-126隨HBV感染的發展而降低，miR-223在急性乙型肝炎中的表達水平最高(15.44±8.52)，在肝癌組中的表達水平最低(6.87±2.11)，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論HBV感染發展不同時期的miRNA表達譜是不同的，通過檢測相關miRNA的表達，可以為HBV感染的慢性化發展提供一個新的研究視角。

關鍵詞：肝癌；微RNA；乙型肝炎

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種嗜肝DNA病毒，我國1～59歲人群中HBV攜帶率約為7.18%[1]。感染HBV后肝臟反復損傷和修復可以引發慢性乙型肝炎，隨著病程遷移，有可能進一步發展為肝硬化，甚至肝癌[2]。最近研究發現，微RNA(microRNA，miRNA)在HBV感染的相關疾病中可能起到重要作用[3]，但是目前HBV感染者、慢性乙型肝炎、肝硬化患者和肝癌患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中miRNA的表達水平變化鮮有報道。為準確地檢測患者病情的動態發展過程，本研究通過檢測HBV感染相關肝病不同階段患者PBMC中相關miRNA的變化，探究miRNA在HBV感染相關肝病中的作用及其在臨床治療中的意義。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年3月至2014年1月于臨高縣人民醫院就診的HBV感染者200例。納入標準：參照中華醫學會傳染病與寄生蟲分會、肝病學分會于2010年聯合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]。排除標準：檢測前接受過放化療的患者，患有其他(如自身免疫性肝炎、脂肪肝、酒精肝、藥物性肝病等)肝臟疾病的患者，妊娠期婦女，嚴重心、腎疾病患者。依據患者診斷情況分為：急性乙型肝炎50例，男30例、女20例，年齡34～61歲，平均(46±12)歲；慢性乙型肝炎50例，男25例、女25例，年齡33～60歲，平均(43±10)歲；肝硬化50例，男28例、女22例，年齡32～59歲，平均(45±10)歲；肝癌50例，男30例、女 20例，年齡32～60歲，平均(49±11)歲。對照組50例，為在臨高縣人民醫院進行體檢的健康人，男25例、女25例，年齡34～59歲，平均(44±12)歲。各組患者及健康對照的性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1試劑Ficoll淋巴細胞提取液(上海研卉生物科技有限公司)，總RNA提取試劑盒(Labaide)，RNA酶抑制劑(上海合星生物科技有限公司)，Trizol(大連寶生物有限公司)，微球(Bio-Rad)，探針序列和微球捕捉序列(上海生工生物工程有限公司)，RNA-DNA嵌合探針(上海吉瑪生物公司)。

1.2.2儀器離心機(Termo)，PCR儀(Bio-Rad)，紫外分光光度計(上海儀電分析儀有限公司)，Luminex液態芯片分析系統(Luminex)。

1.2.3檢測方法①標本采集：常規采集患者外周血5 mL，稀釋后加入Ficoll淋巴細胞提取液，以重力加速度500 g離心10 min，后用毛細管吸出灰色的PBMC。②總RNA的提取：在分離出的PBMC中加入1 mL Trizol，反復吹打。嚴格按照總信使RNA提取試劑盒說明提取總RNA，然后用紫外分光光度計測定其吸光度值(A)，當A260/A280的比值在1.9～2.1，且其最低濃度高于250 mg/L時加入RNA酶抑制劑，儲存于-80 ℃冰箱備用。③RNA-DNA嵌合探針液態芯片檢測miRNA：實驗中用到的探針序列和微球捕捉序列均用Oligo 6.0軟件設計，并由上海生工生物工程有限公司合成，具體詳見表1；實驗中使用miR-103作為內參，將待檢樣本和內參在PCR儀中與嵌合探針進行雜交后，加入包被好的微球，反應30 min后在反應體系中加入2.5 μL 酶切反應液，30 ℃下反應30 min；最后加入熒光染料，在Luminex液態芯片儀上檢測熒光；檢測時取內參讀數的3次熒光信號平均讀數作為有效內參數值，取(靶miRNA分子平均熒光強度-對應本底平均熒光強度)/(有效內參熒光強度-對應本底平均熒光強度)為有效數據。

表1　RNA-DNA嵌合探針序列和微球捕捉序列

2結果

miR-20a、miR-223、miR-126這三種miRNA在各組間的表達差異均有統計學意義(P<0.05)。miR-20a在肝癌組中的表達水平高于對照組、急性乙型肝炎組、慢性乙型肝炎組和肝硬化組(P<0.05)；其在肝硬化組中的表達水平高于對照組、慢性肝炎組和急性肝炎組(P<0.05)；其在慢性乙型肝炎組中的表達也稍高于對照組和急性乙型肝炎組，但差異無統計學意義(P>0.05)。miR-223在肝癌組的表達水平低于對照組、急性乙型肝炎組和慢性乙型肝炎組(P<0.05)；其在肝癌組中的表達水平也稍低于肝硬化組，但差異無統計學意義(P>0.05)；miR-223在肝硬化組的表達水平也低于急性乙型肝炎組(P<0.05)。miR-126在肝癌組中的表達水平低于對照組、急性乙型肝炎組和慢性乙型肝炎組(P<0.05)；miR-126 在肝硬化組中的表達水平低于對照組和急性乙型肝炎組(P<0.05)；其在肝癌組中的表達稍低于在肝硬化組中的表達，但差異無統計學意義(P>0.05)。各組miR-21、miR-31、 miR-145、miR-222、miR-191、miR-372比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　HBV感染不同時期外周血中單個核細胞的miRNA的表達結果　±s)

HBV：乙型肝炎病毒；對照組：健康者；a與對照組比較，P<0.05;b與急性乙型肝炎組比較,P<0.05；c與慢性乙型肝炎組比較,P<0.05

3討論

miRNA是一種以序列特異性調控相關基因轉錄后表達的內源性非編碼的單鏈小RNA，普遍參與發育、增殖、分化、凋亡、炎癥等一系列生理及病理過程[5]。miRNA可與目的基因的3′端非翻譯區結合，通過堿基配對導致目的信使RNA降解，或者通過非完全堿基配對阻礙信使RNA的翻譯[6]。目前為止miRBase數據庫中已有1424種人類的miRNA、720種小鼠的miRNA和408種大鼠的miRNA[7]。利用miRNA來診斷甚至治療疾病已成為熱點[8- 9]。miRNA不僅存在于各種細胞中，而且可被釋放到循環系統中，并可以在大多數體液中檢測到。

本研究結果表明，miR-21、miR-31、miR-145、miR-222、miR-191、miR-371在HBV感染者和對照組PBMC中的表達水平差異無統計學意義，提示這5種miRNA與HBV感染及各個時期的發展沒有關系。miR-20a的表達水平隨著HBV感染的發展而逐步提高，提示miR-20a可能參與了HBV感染者病情的發展過程，還可能是肝癌的重要致病性miRNA分子之一。miR-223在急性乙型肝炎中表達量最高，在肝癌組表達量最低；miR-126的表達水平隨著HBV感染的發展而逐步降低，提示miR-223和miR-126這兩種miRNA的表達水平可能與HBV的慢性化發展緊密相關。miR-20a在多種疾病中均報道有異常表達情況，可能起著癌基因的作用[10]。如在膽囊癌患者組織中miR-20a表達水平顯著高于正常人，且隨著病情的加重miR-20a的表達量升高[11]；miR-20a在胃癌組織中也存在高表達情況，其可能也與胃癌的原位發生密切相關[12]。miR-223的表達水平在肝癌患者中最低，在急性乙型肝炎患者中最高；miR-126的表達水平隨著HBV感染的發展而逐步降低，說明這兩個miRNA的表達水平可能與HBV感染的不同時期有關。miR-223為粒細胞系中高表達的一種控制炎性反應的分子[13]。曾有報道，miR-223基因缺失的小鼠粒細胞表型高度成熟，對刺激的敏感度、殺菌功能均有所增強，導致小鼠易患肺炎，組織損傷加劇[14-15]。本研究在HBV感染發展程度最高的肝癌患者PBMC中的表達量明顯偏低，可能會引起粒細胞功能過強，從而引起高炎癥反應。這可能也是HBV感染后病情發展的一個因素。miR-126位于EGFL7 基因的內含子中，在正常人含血管豐富的組織中高表達。miR-126是一種抑癌基因，目前普遍認為其可以抑制一些腫瘤的增殖和轉移，其在胃癌、乳腺癌、原發性膀胱腫瘤等疾病中表達量明顯降低[16]。

綜上所述，從HBV急性感染經過慢性乙型肝炎、肝硬化發展到肝癌的過程中不同miRNA的表達譜可能會隨著病情的發展而變化。本研究結果顯示，miR-20a、 miR-223、miR-126三種miRNA的表達水平均隨著HBV感染后病情的發展而變化，通過監測相關miRNA的變化可以為相關疾病的發展機制提供新的研究視角。

參考文獻

[1]王濤,陳東風.乙型肝炎病毒受體研究近況與展望[J].肝臟,2013，18(7):493-495.

[2]李靜,李朝霞,毛維武,等.乙型肝炎病毒感染與肝細胞癌關系的新進展[J].醫學綜述,2012,18(18):2988-2991.

[3]Li LM,Hu ZB,Zhou ZX,etal.Serum microRNA profiles serve as novel biomarkers for HBV infection and diagnosis of HBV-positive hepatocarcinoma[J].Cancer Res,2010,70(23):9798-9807.

[4]Cuperus JT,Fahlgren N,Carrington JC.Evolution and functional diversification of MIRNA genes[J].Plant Cell,2011,23(2):431-442.

[5]Marín RM,Vanícekek J.Efficient use of accessibility in microRNA target prediction[J].Nucleic Acids Res,2011,39(1):19-29.

[6]Kozomara A,Griffiths-Jones S.miRBase:integrating microRNA annotation and deep-sequencing data[J].Nucleic Acids Res,2011,39(suppl 1):152-157.

[7]Borel F,Konstantinova P,Jansen PL.Diagnostic and therapeutic potential of miRNA signatures in patients with hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol,2012,56(6):1371-1383.

[8]Pin AL,Houle F,Guillonneau M,etal.miR-20a represses endothelial cell migration by targeting MKK3 and inhibiting p38 MAP kinase activation in response to VEGF[J].Angiogenesis,2012,15(4):593-608.

[9]Chang Y,Liu C,Yang J,etal.miR-20a triggers metastasis of gallbladder carcinoma[J].J Hepatol,2013,59(3):518-527.

[10]Wang M,Gu H,Wang S,etal.Circulating miR-17-5p and miR-20a:molecular markers for gastric cancer[J].Mol Med Report,2012,5(6):1514-1520.

[11]Bauernfeind F,Rieger A,Schildberg FA,etal.NLRP3 inflammasome activity is negatively controlled by miR-223[J].J Immunol,2012,189(8):4175-4181.

[12]Nakanishi K,Nakasa T,Tanaka N,etal.Responses of microRNAs 124a and 223 following spinal cord injury in mice[J].Spinal Cord,2009,48(3):192-196.

[13]Johnnidis JB,Harris MH,Wheeler RT,etal.Regulation of progenitor cell proliferation and granulocyte function by microRNA-223[J].Nature,2008,451(7182):1125-1129．

[14]劉艷紅,趙艷潔,房淑娟,等.肝癌相關基因的分子克隆和可變剪切分析[J].中南大學學報：醫學版,2013,38(9):869-875.

[15]Feng R,Chen X,Yu Y,etal.miR-126 functions as a tumour suppressor in human gastric cancer[J].Cancer Lett,2010,298(1):50-63.

[16]Hamada S,Satoh K,Fujibuchi W,etal.MiR-126 acts as a tumor suppressor in pancreatic cancer cells via the regulation of ADAM9[J].Mol Cancer Res,2012,10(1):3-10.

統一同一時體論：宇宙無限。包括萬事、萬物；有機、無機；生命、非生命；物質、精神等，所有都包容在宇宙體內，是一個統一體，是一個完整的體系。宇宙間的任何個體，都發生在某時間段與變化的空間內，所以任何個體均是時間和空間共同構建成的同一時體。宇宙間的任何個體被各種各樣的規律控制著，若大的宇宙與大小不一的個體，都在循道規律而動。無限與有限，宏觀與微觀，整體與部分都遵循著統一同一時體和諧的運動。和諧地運動維護了統一，運動地和諧維護了同一。

———劉桂蕊

Expression Profile and Significance of miRNA in Different Periods of HBV InfectionQINHai-yu，CHENYu-hui.(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofLingaoCounty，Lingao571800，China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the expression profile and significance of miRNA different periods of HBV infection.MethodsTwo hundred patients infected by HBV from Lingao County People′s Hospital during Mar.2012 and Jan.2014 were selected in this study.Among them,there were 50 patients with acute hepatitis B,50 with chronic hepatitis B,50 with hepatitis B liver cirrhosis,50 with liver cancer and 50 healthy control.The expression level of miR-20a,miR-21,miR-31,miR-145,miR-222,miR-191,miR-371,miR-223 and miR-126 were detected by xMap liquid chip technology after extracting mononuclear cells from peripheral blood.ResultsThere were no statistically differences of miR-21miR-31,miR-145,miR-222,miR-191,miR-371 in different groups(P>0.05).As the progression of the disease,the expression level of miR-20a increased significantly,while miR-126 decreased greatly.The expression level of miR-223 was the highest in acute hepatitis B group (15.44±8.52),while it was the lowest in the liver cancer group (6.87±2.11),the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression profile of miRNA in different periods of HBV infection is different,which provides a new clue to the research of the mechanisms of the chronicity of HBV infection.

Key words:Liver cancer; MicroRNA; Hepatitis B

收稿日期：2014-05-26修回日期：2015-06-15編輯：樓立理

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.071

中圖分類號：R512.62

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)19-3647-03