hs-CRP基因及rs1205基因多態性與腦梗死的相關性研究

作者單位:617000 四川 攀枝花,四川省攀枝花市中心醫院檢驗科

羅　茜

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hs-CRP基因及rs1205基因多態性與腦梗死的相關性研究

作者單位:617000 四川 攀枝花,四川省攀枝花市中心醫院檢驗科

羅茜

[摘要]目的分析并評價超敏C-反應蛋白(hs-CRP)基因及rs1205基因多態性與腦梗死的相關性。方法將我院神經內科急診室2012年1月～2013年8月收治的113例中老年腦梗死患者作為觀察組,以同期113例健康體檢者作為對照組；通過免疫透射比濁法測定血清hs-CRP含量；以聚合酶鏈式反應(PCR)及限制性片段長度多態(RFLP)方法測定rs1205基因的多態性；采用美國國立衛生院神經功能缺損評分(NIHSS)量表評定神經功能。結果觀察組與對照組的基因型頻率與等位基因的分布趨勢一致,差異不顯著(P>0.05)；重度患者的hs-CRP含量顯著高于輕、中度兩組(P<0.05)；rs1205基因型與腦梗死病情程度未見相關性(P>0.05)。結論hs-CRP含量與腦梗死患者病情密切相關,rs1205基因多態性與腦梗死發病之間未見相關性。

[關鍵詞]腦梗死；超敏C反應蛋白；基因型；基因頻率

Study on correlation between hs-CRP gene and rs1205 gene polymorphism and cerebral infarction

Luo QianDepartment of Laboratory, Central Hospital of Panzhihua City, Panzhihua, Sichuan, 617000, China

[Abstract]ObjectiveTo study the correlation between high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) gene and rs1205 gene polymorphism with cerebral infarction.MethodsThe 113 middle-aged and senile patients with cerebral infarction to receive emergency treatment in Department of Neurology of our hospital from Jan. 2012 to Aug. 2013 constituted an observation group, and 113 healthy people constituted a control group. Immune turbidimetric method was used to determine the contents of hs-CRP, polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) methods were used to determine the rs1205 gene polymorphism, and America National Institute of Health Stroke Scale (NIHSS) was used to determine the nerve function.ResultsThe distribution trends of the genotype frequency and allele in both groups were uniform, and the difference was not significant (P>0.05); the contents of hs-CRP in patients with severe cerebral infarction were significantly higher than those in patients with mild and moderate cerebral infarction (P<0.05); there was no correlation between rs1205 genotype and severity of the illness (P>0.05).ConclusionThe contents of hs-CRP in patients with cerebral infarction are closely related to the severity of cerebral infarction, and there was no correlation between rs1205 gene polymorphism and cerebral infarction.

[Key words]cerebral infarction; high-sensitivity C-reactive protein; genotype; gene frequency

C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)是在機體受損、發生感染或出現炎癥時引起血漿濃度急劇上升的重要急性期蛋白[1]。采用免疫增強比濁法大大提高了分析的靈敏度(檢測低限為0.005~0.100 mg/L),此類方法所測定的CRP被稱為超敏C反應蛋白(hs-CRP)。一直以來,hs-CRP被視為重要的非特異的炎癥標志物。但近年來的研究顯示,hs-CRP與機體炎癥、動脈粥樣硬化等心血管疾病過程密切相關[2]。大量文獻報道顯示,單獨測定血清hs-CRP含量能夠指示或預測首發與再發腦血管事件[3-5]。目前關于hs-CRP基因及rs1205基因多態性與腦梗死的相關性研究鮮有報道,本研究通過對比老年腦梗死患者與健康體檢者的臨床資料,旨在評價hs-CRP基因及rs1205基因多態性與腦梗死的相關性。

1對象與方法

1.1研究對象我院神經內科急診室于2012年1月～2013年8月共收治113例中老年腦梗死患者,將其作為觀察組,其中男性79例,女性34例；年齡38~91(64.3±12.1)歲；病程均≤3 d；均符合全國第四屆腦血管病學術會議通過的臨床診斷標準,同時采用頭顱CT/MRI進一步確診；按照美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)進行病情分級評定:輕度63例(NIHSS分<6),中度39例(NIHSS分6~13),重度11例(NIHSS分≥14)。平均體重指數(BMI)為(24.32±6.38)kg/m2。其中22例有腦卒中家族史,94例有高血壓病史,24例有糖尿病史,31例有冠心病史,49例有吸煙史,23例有飲酒史。另選同期我院門診113例體檢者作為對照組,其中男性69例,女44例；年齡47~82(61.9±10.4)歲；平均BMI為(23.92±8.31)kg/m2。其中1例有腦卒中家族史,27例有高血壓病史,13例有冠心病史,1例有糖尿病史；17例有吸煙史,10例有飲酒史。兩組均排除伴有嚴重肝腎功能不全者、腦出血、周圍血管疾病、血液病、大動脈炎、結核、重癥肺部感染、惡性腫瘤以及曾接受器官移植者。兩組在年齡、性別、BMI等方面相比無顯著差異(P>0.05),具有可比性。

1.2血清hs-CRP含量測定全部受檢者清晨空腹(腦梗死患者在發病24 h內,少數患者發病在3 d內)抽取2 ml靜脈血,使用荷蘭Vital全自動生化分析儀進行分析,通過免疫透射比濁法測定hs-CRP含量,所需檢測試劑盒均購自四川邁克科技有限責任公司。

1.3CRP基因型分析(1)抽取5 ml肘靜脈血,選擇低滲溶血及酚氯仿法提取外周血白細胞基因組DNA,TE緩沖液溶解保存；通過PCR與限制性片段長度多態性(RFLP)分析rs1205基因多態性,所需酶切及PCR試劑均購自上海生工生物工程有限公司,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。(2)25 μl的反應體系包括:10×PCR緩沖液2.5 μl,1 μl 25 mM Mg2+,25 nM 4×dNTP 1 μl,10 μM上、下游引物各1 μl,1 μl基因組DNA模板,0.5 μl Taq DNA聚合酶5 U/μl,2.5 μl二甲基亞砜。擴增程序:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,54 ℃退火50 s,72 ℃延伸55 s,共22個循環,最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存待用。限制性內切酶酶切反應體系總體積20 μl,包括:10 μl PCR擴增產物,2 μl 10×Buffer,2 U內切酶,在37 ℃條件下酶切14 h。將pUC19DNA/MspI酶解片段作為DNA片段的標準物,配置濃度為20%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,結果見圖1。

表1hs-CRP基因rs1205 SNP位點、引物序列、內切酶以及酶切片段

引物序列(5'→3')內切酶片段(bp)正向:AACAGGGGCTTTATTGGCTTAATaaICC型:149bp,128bp反向:AATACCCAGGCCACAAGAGTGGCT型:275bp,149bp,128bpTT型:275bp,128bp

圖1　rs1205基因酶切片段20%的

2結果

2.1兩組基因型對比結果在全部受檢者中,rs1205基因型的頻率依次為CC 17.3%、CT 48.7%、TT 34.1%；等位基因C頻率為0.416,等位基因T頻率為0.584,符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.017,P=0.891)。兩組受檢者的基因型頻率與等位基因的分布趨勢一致,無統計學差異(P>0.05),見表2。

2.2觀察組CRP基因型影響hs-CRP含量情況rs1205的CC、CT、TT三種基因型的Log CRP含量依次為(0.355±0.599)、(0.249±0.601)及(0.168±0.641)mg/L,三者基因型的血清Log CRP含量雖依次遞降,但三者差異比較無統計學意義(P>0.05)。

表2　兩組rs1205基因型及等位基因頻率

2.3不同程度腦梗死患者的hs-CRP含量比較對觀察組患者采用NIHSS將其分成3組:輕度組、中度組及重度組。重度患者的hs-CRP與Log CRP含量均顯著高于輕、中度兩組(P<0.05)；而輕、中度患者的hs-CRP與Log CRP含量相比無顯著差異(表3)。

表3　不同程度腦梗死患者的hs-CRP含量比較

注:同輕度及中度組比較,①P<0.05

2.4hs-CRP基因型與NIHSS評分交叉分析將觀察組患者rs1205基因型與NIHSS評分制表,采取χ2檢驗,rs1205基因型與腦梗死程度未見相關(P>0.05,表4)。通過對三類基因型進行測序顯示,在CRP1846C>T的擴增產物中,CC基因型中的C突變為TT基因型中的T,與酶切結果完全相符。

表4　hs-CRP基因型與NIHSS評分交叉分析

3討論

目前已證實動脈粥樣硬化是腦梗死的基礎病因,而且大量文獻資料顯示,腦梗死是一個慢性炎性過程[6]。Nozue等[7]的研究顯示,性別、年齡及體重等指標能夠影響血清CRP含量。CRP能夠激活補體,同時增強吞噬細胞的吞噬能力,進而發揮調理功能,有效清除入侵機體的病原菌,修復并清理損傷、壞死及程序化死亡的組織細胞,在天然免疫過程中起保護作用,CRP已被認為是心血管疾病最敏感的保護因子[8]。rs1205基因多態性是CRP最為常見的多態性之一,其位于CRP基因的3′端非翻譯區[9]。不同研究機構關于rs1205影響hs-CRP含量的研究結果各不相同[10]。本研究結果顯示,帶有rs1205T等位基因的受檢者血清hs-CRP含量低,但與CRP含量之間無明顯的相關性,分析這可能是由于CRP的含量變化由諸多因素決定,而且遺傳方面的影響不大[11]。

不同種族、不同地區人群的rs1205的分布各不相同[12]。通過對NCBI中SNP數據庫查詢顯示,歐洲人rs1205T等位基因頻率為0.33,非洲人rs1205T等位基因頻率為0.15,黃種人(北京地區)則為0.56。在本研究中,rs1205T基因多態性位點共有CC、CT及TT三種基因型,其中等位基因T的頻率為0.58。本研究所得等位基因T的分布頻率顯著高于歐洲人,且與中國北京黃種人的分布頻率基本相似[13]。這表明T等位基因頻率在不同人種的分布是不同的。

大量文獻報道顯示,CRP含量與缺血性腦梗死的發病密切相關,而關于CRP基因多態性與缺血性腦梗死的相關性卻并無定論[14]。Di Napoli等[15]分析了4個人類CRP 基因多態性基因型:rs1341 662、rs1130864、rs1800947及rs1205后發現,僅rs1800947與缺血性腦梗死有明顯的相關性。Tanno等[16]對4個基因多態性位點(rs1205、rs3093075、rs1800947及rs1130864)進行分析,結果顯示無相關的SNP位點或SNP單體型與缺血性腦梗死具有關聯,但3個SNP位點(rs1130864、rs1800947及rs3093075)與微血管閉室密切相關。Park等[17]的研究亦未見rs1205與缺血性腦梗死具有相關性,但單體型H3與缺血性腦梗死密切相關。本研究未對腦梗死類型進行細致劃分及構建單體型,結果顯示重度組腦梗死患者的hs-CRP含量明顯高于輕度組與中度組,rs1205基因型與腦梗死及腦梗死病情的嚴重程度均無相關性,與以往報道的結果相符。

總之,本研究結果顯示,hs-CRP含量與腦梗死患者病情密切相關,rs1205基因多態性與腦梗死發病之間未見相關性。

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(收稿日期:2014-08-31)

文章編號1004-0188(2015)03-0252-04

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.03.008

中圖分類號R 743.33

文獻標識碼A