雙酚A對青島大扁藻的干擾效應

向昆侖, 王晶晶, 唐思, 段舜山,*

1. 暨南大學水生生物研究中心, 水體富營養化與赤潮防治廣東普通高校重點實驗室, 廣州 510632 2. 廣東省海洋與漁業環境監測中心, 廣州 510000

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雙酚A對青島大扁藻的干擾效應

向昆侖1, 王晶晶2, 唐思1, 段舜山1,*

1. 暨南大學水生生物研究中心, 水體富營養化與赤潮防治廣東普通高校重點實驗室, 廣州 510632 2. 廣東省海洋與漁業環境監測中心, 廣州 510000

為了探討雙酚A(bisphenol A, BPA)對海洋微藻的生態毒性效應，實驗選擇了以青島大扁藻(Platymonas helgolanidica)作為受試物種，設置6個實驗濃度(即0、2、4、6、8、10 mg·L-1)對微藻進行了96 h暴露處理，測定了不同濃度暴露下對青島大扁藻的生長以及抗氧化系統酶活性等指標。研究結果表明，BPA對青島大扁藻的96h-EC50為9.32 mg·L-1，屬高毒類污染物。青島大扁藻經過BPA暴露處理后，細胞密度下降，細胞色素含量降低，并且呈現明顯的劑量-效應關系；細胞抗氧化系統中超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性均受到干擾。

雙酚A; 青島大扁藻;干擾效應

雙酚A(bisphenol A, BPA)屬于苯酚和丙酮的衍生物，是重要的有機化工原料[1]，年產量超過60億磅[2]。它廣泛應用于物品包裝穩定化和抗氧化處理過程，與人類生活關系密切。與大多數污染物一樣，BPA在生產和應用過程中絕大部分會經過各種途徑進入水體，BPA本身親脂性強，易在生物體中富集并能隨著食物鏈發生傳遞[3]。研究表明，BPA對人類和動物個體的生理、生殖以及子代發育產生負面影響[4-7]。在水體介質中(地表水)的BPA的含量范圍為0.002～112.0 μg·L-1[8]，占到了在各環境介質中分布總含量的半數以上，世界各地水域均有BPA被檢出，其含量范圍為0.0005～4.00 μg·L-1[9-12]，且檢出量逐年上升。BPA對生活在水中的大型溞和斑馬魚卵發育有顯著的抑制作用，甚至有致畸作用[13]。此外雙酚A還可以通過直接或者間接機制增加人體和水生動物的患癌風險[14]。目前，有關BPA對人類和哺乳動物等的毒性效應均有報道，但對于海洋微藻的毒性效應研究較少。

海洋微藻是海洋生態系統中最主要的初級生產者，是整個海洋食物鏈的基礎。其對水環境的各種變化極為敏感[15]，藻類對污染物不同的響應結果會通過食物網影響著整個水域生態環境的穩定。青島大扁藻(Platymonas helgolanidica)屬于綠藻門、綠藻綱、團藻目、衣藻科、扁藻屬。在我國沿海水域廣泛分布，并且適應性強，個體微小，結構簡單，是較為理想的受試物種。本文以青島大扁藻為受試物種，測定了其在BPA不同濃度干擾下生長密度、光合特性、抗氧化系統的響應情況，初步探討了BPA對該藻的生理干擾機理，以期對BPA的海洋水域生態風險評估提供參考資料。

1 材料方法(Materials and methods)

1.1 實驗藥品

雙酚A(Bisphenol, BPA)：分子量為228.29，純度≥98%，購自上海阿拉丁試劑公司。

1.2 藻種培養

實驗所需藻種青島大扁藻(Platmonas helgolanidica)由暨南大學水生生物研究中心藻種室提供。采用改良的f/2培養基靜置培養，人工海水為基礎介質。光照強度100 μmol·m-2·s-1，光暗周期12 h (L):12 h (D)，培養溫度25±2 ℃。藻種經過兩個周期的活化和擴大培養后用于實驗。

1.3 實驗設計

以1‰二甲基亞砜作為助溶劑，經預實驗分析得出二甲基亞砜的無可觀察效應劑量濃度(No observed effect level, NOEL)為1‰。BPA設置6個實驗濃度，即2、4、6、8、10 mg·L-1和對照組(1‰二甲基亞砜)對微藻96 h暴露處理，對照組加入等量助溶劑。f/2培養基經高溫滅菌處理，接種指數生長期的青島大扁藻細胞后，分裝于250 mL的三角瓶中，培養體積為200 mL，放置于人工氣候培養箱中進行一次性培養。每個處理設置三個平行，每天搖瓶3次，并隨機更換三角瓶的位置，以避免光照不均勻。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 細胞生長的測定

各暴露處理過程中，每隔24 h取藻液2 mL，于顯微鏡下細胞計數，然后轉化為細胞密度，繪制藻類生長曲線，以細胞密度的變化反映藻細胞的生長情況。

1.4.2 光合色素含量的測定

光合色素的提取和測定參考文獻[16]并在此基礎上加以改良。取單一暴露和聯合暴露處理96 h的藻液6 mL離心15 min(5 000 r·min-1)，棄上清，加入5 mL抽提液(丙酮：乙醇=1:1配制)，震蕩搖勻，黑暗處4 ℃靜止抽提24 h，同轉速離心15 min，取上清液于440 nm、645 nm、663 nm波長下測定吸光值，以空白抽提液為對照，得出3種細胞色素的濃度，并分別換算成單位密度下的色素濃度。色素濃度(mg·L-1)計算公式如下：

葉綠素a=12.7OD663-2.69OD645

葉綠素b=22.9OD645-4.68OD663

葉綠素總量=葉綠素a+葉綠素b=20.2OD645+8.02OD663

類胡蘿卜素=4.70OD440-0.27(葉綠素a+葉綠素b)

1.4.3 細胞內抗氧化酶活性測定

粗酶液提取方法參考Ma 和Kn?rzer[17-18]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性測定采用氮藍四唑法；抗壞血酸過氧化物酶(aseorbateperoxidase, APX)活性測定方法參考Nakano 和Asada[19-20]；單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase, MDHAR)活性測定方法參考Miyake[21]；脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase, DHAR)活性測定方法參考Dalton 和Nakano[21-22]；谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)活性測定方法參考Grace[23]。

1.5 數據分析及處理

數據采用EXCEL 2007和SPSS 13.0進行統計分析。

2 結果(Results )

2.1 雙酚A暴露對青島大扁藻細胞密度的影響

青島大扁藻經過雙酚A暴露96 h處理后，對藻細胞的生長影響情況，如圖1所示。研究發現，隨著暴露時間的延長，各濃度處理組的細胞密度均逐漸升高。但隨著雙酚A暴露濃度的增加，升高趨勢逐級減弱，與對照組相比，處理組均表現出生長受抑制效應。雙酚A暴露濃度與抑制程度兩者正相關，說明青島大扁藻細胞的生長與雙酚A暴露濃度呈現出明顯的劑量-效應關系。10 mg·L-1處理組其96 h的抑制率達到了60.48%。肉眼觀察下藻液顏色明顯變淺。通過SPSS軟件計算得出雙酚A對青島大扁藻96h-EC50[24]為9.32 mg·L-1，如表1所示。

表1 雙酚A對青島大扁藻的96h-EC50

2.2 雙酚A暴露對青島大扁藻的細胞色素含量的影響

青島大扁藻經過雙酚A暴露96 h處理后，對單位細胞密度下的細胞葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素含量的影響，如圖2所示。雙酚A作用濃度為2 mg·L-1時，即開始誘導Chla、Chlb以及Car含量下降，且隨著作用濃度的上升，三者下降幅度逐漸加大，均表現出良好的劑量-效應關系。10 mg·L-1作用濃度下，青島大扁藻細胞Chla、Chlb以及Car含量分別較對照下降了79.32%、85.73%、68.41%，其中Chlb對雙酚A作用最為敏感。

2.3 雙酚A暴露對青島大扁藻SOD酶活性的影響

青島大扁藻經過雙酚A暴露96 h處理后，其超氧化物歧化酶(SOD)活性響應情況，如圖3所示。與對照相比，隨著BPA濃度的升高，各處理組酶活性均受到雙酚A誘導活性上升，并且這種上升趨勢隨著BPA濃度的增大而逐漸增大。當BPA作用濃度為8 mg·L-1時，SOD酶活性達到最大，比對照增大了40.84%；當BPA作用濃度達到10 mg·L-1時，酶活性略有下降，但相比對照增大了27.98%。

圖1 BPA暴露處理對青島大扁藻細胞密度的影響注：*表示與對照有顯著差異(P<0.05)Fig. 1 Cell density of P. helgolanidicaunder differentconcertrations of BPANote: *stands for significant difference compared with CK (P<0.05)

圖2 BPA暴露96 h處理對青島大扁藻單個細胞色素含量的影響注：*表示與對照有顯著差異(P<0.05)Fig. 2 Pigment contents of P. helgolanidicaunder different concentrations of BPANote : * stands forsignificant difference compared with CK (P<0.05)

圖3 BPA暴露96 h處理對青島大扁藻超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注：*表示與對照有顯著差異(P<0.05)Fig. 3 Effect of BPA on the SOD activity of P. helgolanidicaNote : *stands for significant differencecompared with CK (P<0.05)

2.4 雙酚A暴露對青島大扁藻抗壞血酸-谷胱甘肽循環酶活性的影響

青島大扁藻經過雙酚A暴露96 h處理后，藻細胞內抗壞血酸-谷胱甘肽循環酶活性的影響，如圖4所示。本實驗條件下，6種濃度BPA處理對青島大扁藻的抗壞血酸-谷胱甘肽循環均起到了一定的誘導作用。除谷胱甘肽還原酶(GR)外，抗壞血酸過氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)在較低濃度暴露(2～4 mg·L-1)時，隨著濃度的升高3種酶的活性逐漸增強，4 mg·L-1時達到峰值。當BPA作用濃度繼續升高時，酶活性則持續下降，但各組均高于對照組。而谷胱甘肽還原酶(GR)則隨著作用濃度的升高酶活性持續增大，10 mg·L-1時最大，相比對照組增大了53.73%。

3 分析與討論(Analyze and discussion)

3.1 不同濃度的BPA對青島大扁藻生長的干擾效應

BPA對青島大扁藻的生長具有抑制作用，抑制程度表現為良好的劑量-效應關系，與李睿[25]的研究結果一致。本實驗中BPA對青島大扁藻96 h EC50為9.32 mg·L-1，屬于高毒類有機化合物。

研究表明，葉綠素含量的變化能夠較好得反映生物各個階段的生長發育情況是否正常[26]。本實驗中，隨著BPA處理濃度的增大，葉綠素a呈現明顯的下降趨勢，這與荊國華[27]的研究結果一致。其原因一方面可能是BPA脅迫導致葉綠體產生的大量活性氧，活性氧在未能及時清除情況下有足夠的時間氧化葉綠體膜，造成基質外漏，代謝功能紊亂、葉綠體結構破壞，葉綠素a含量下降[25]。另一方面可能是由于葉綠體片層中捕光Chla/b-pro復合體的過程合成受到抑制，或者是合成受阻以及被氧化而加速降解這兩個過程同時作用的結果[28]。

圖4 BPA暴露96 h處理對青島大扁藻抗壞血酸-谷胱甘肽循環中四種關鍵酶活性的影響注：*表示與對照有顯著差異(P<0.05)Fig. 4 Effect of BPA on the activities of four key enzymes in ascorbate-glutathione cycleNote : * stands forsignificant difference compared with CK (P<0.05)

類胡蘿卜素不僅是一種重要的捕光色素，也是一種重要的抗氧化劑。能通過和自由基發生反應或者破壞自由基鏈反應，起到清除和猝滅有害自由基的作用。青島大扁藻受BPA暴露96 h處理后，各濃度組類胡蘿卜素含量呈現下降趨勢可能是受活性氧氧化的結果[29]。

3.2 對青島大扁藻抗氧化系統的干擾效應

一般認為，一定劑量的毒性物質暴露會導致藻類的光合效率下降，產生過剩激發能，并誘導產生大量活性氧分子。藻體內的SOD酶的主要功能就是催化猝滅有害活性氧，保護細胞免受傷害。本實驗中SOD活性的升高可能是由于細胞間硫醇類抗氧化物質含量升高激發了SOD基因的大量表達[30]，或者是氧化壓力反應基因與控制離子平衡基因受激發共活化所致，因為兩者的調節轉錄因子有重疊[31]。當BPA濃度繼續升高，SOD活性略有下降，可能是因為過量的活性氧超過了SOD催化的閾值，對酶本身的結構造成氧化損傷所致。

研究表明，適度的逆境脅迫可以提高抗壞血酸-谷胱甘肽循環中酶的活性[32]。本研究結果中，各處理組的四種酶活性均較對照組有不同程度的上升，與相關的研究結果類似[33,34]。酶活性的升高可能是活性氧刺激相關酶基因的過度表達導致[35]。而在高濃度處理組中，APX、MDHAR、DHAR活性略有下降，可能原因有：1、高濃度脅迫下導致細胞活性氧過量積累，對酶結構本身造成一定程度的損害[36]；2、高濃度的BPA處理導致青島大扁藻光合作用效率明顯下降，光合作用過程被嚴重抑制，進而導致APX活性降低[37]。而GR活性持續上升可能與還原性谷胱甘肽有關。另外，由于GSH在清除活性氧過程中被大量氧化，導致氧化性谷胱甘肽(GSSG)含量增加，GR受到催化的底物的調節酶活性持續升高。

青島大扁藻抗氧化系統中多種酶受到BPA誘導活性均較對照升高，一定程度上對逆境脅迫表現出積極的響應，但是毒物干擾細胞生長、細胞色素含量減少等導致細胞密度隨著脅迫程度的增加逐級下降，并呈現出良好的劑量-效應關系。因此，青島大扁藻是BPA在水域生態的風險評價中的良好受試物種，另外其對BPA脅迫表現出的各種生長、生理代謝響應也為發展環境激素海洋生態毒理學提供了參考資料。

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◆

Interference Effects of Bisphenol A onPlatymonashelgolanidica

Xiang Kunlun1, Wang Jingjing2, Tang Si1, Duan Shunshan1,*

1. Research Center of Hydrobiology, Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institutes, Jinan University, Guangzhou 510632, China 2. Centre of Oceanic and Fishery Environment Monitoring of Guangdong Province, Guangzhou 510000, China

Received 19 December 2014 accepted 8 February 2015

The effects of bisphenol A (BPA) on the growth of Platymonas helgolanidica were studied, so as to explore the ecological toxicity effects of BPA on marine microalgae. The exposure concentrations of BPA were 0, 2, 4, 6, 8, and 10 mg·L-1. The parameters such as cell densities, antioxidant enzyme systems , as well as 96 h EC50of P. helgolanidica under different BPA concentrations were measured during the experimental period. The results showed that 96h-EC50of BPA for P. helgolanidica was 9.32 mg·L-1, indicating that BPA was a high toxic pollutant to P. helgolanidica. When P. helgolanidica was exposed to BPA at the above concentrations, the growth of P. helgolanidica was inhibited: both the cell density and cell pigment content was decreased, which was demonstrated by dose effect-relationships. Besides, the activities of superoxide dismutase (SOD), ascorbic acid peroxidase (APX), dehydroascorbate reductase (MDHAR), dehydroascorbate reductase (DHAR), and glutathione reductase (GR) in cells were disturbed in the study.

bisphenol A; Platymonas helgolanidica; interference effects

NSFC-廣東省聯合基金重點項目(U1133003): 國家重點科學基金項目(41176104)

向昆侖(1990-), 男, 碩士研究生, 從事浮游植物方面研究, E-mail: xkl20130426@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: tssduan@jnu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20141219003

2014-12-19 錄用日期：2015-02-08

1673-5897(2015)3-262-06

X171.5

A

段舜山(1955-), 男, 教授, 博士生導師, 主要從事藻類生理生態學研究, 發表SCI等各類論文100多篇

向昆侖, 王晶晶, 唐思, 等. 雙酚A對青島大扁藻的干擾效應[J]. 生態毒理學報，2015, 10(3): 262-267

Xiang K L, Wang J J, Tang S, et al. Interference effects of bisphenol A on Platymonas helgolanidica [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 262-267 (in Chinese)