Cd2+對BY-2細胞的毒性機制及水楊酸的緩解作用

張明軒，李穎邦，劉愛云，張學文

湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128

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Cd2+對BY-2細胞的毒性機制及水楊酸的緩解作用

張明軒，李穎邦，劉愛云，張學文*

湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128

鎘對生態環境的危害表現出對植物這種定生生物的毒害性。以綠色熒光蛋白(GFP)膜泡標記的煙草BY-2細胞為實驗材料，分別在熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察了Cd2+對植物細胞的毒害作用和機制，并研究了水楊酸(SA)處理對Cd2+植物細胞毒害的緩解作用。研究發現激光共聚焦顯微鏡可以觀察到Cd2+處理3 h后細胞熒光亮度減弱，6 h時細胞皺縮和液泡縮小，9 h細胞大多死亡。在Cd2+脅迫同時加入SA，可顯著提高細胞成活時間，熒光亮度增強、液泡化程度加大，同時能夠觀察到熒光標記的細胞膜包裹Cd2+的高熒光顆粒。SA處理的細胞還通過高度液泡化來緩解重金屬Cd2+的毒性。結果表明具有生物活性的SA誘導細胞的液泡化，并通過膜成分對重金屬的包裹和結合進一步降低了重金屬對植物細胞的毒害。因此水楊酸緩解重金屬對植物細胞的毒性，是通過誘導細胞的液泡化和膜對重金屬離子的包裹束縛而實現的。

鎘；水楊酸；熒光標記BY-2細胞；聯合作用

隨著工農業的持續發展，工業污水和廢渣繼續排放，化肥的大量使用，造成我國土壤和水源的重金屬污染加劇[1]。過量的重金屬會對植物有毒害作用，并且通過食物鏈和生物富集作用，最終會危害到人體健康，帶來一系列的社會問題[2-3]。重金屬污染問題已經日益受到人們的重視，植物對重金屬脅迫抵御機制的研究也在日益深入。重金屬在植物體內會不斷累積，當累積超過一定的閥值之后，會對植物細胞結構造成不可逆轉的損傷，并最終影響到植株體的正常生理活動[4]。為應對重金屬脅迫帶來的損傷，植物進化出獨特的防御機制，如通過提升一些保護酶的活性、激素含量水平的變化等措施來降低受到的傷害[5]。水楊酸(salicylic acid，SA)是一種酚類化合物，普遍存在于植物體內，其化學名稱為鄰羥基苯甲酸[6]。由于SA存在增強植物在熱脅迫、鹽害、低溫、干旱、等非生物脅迫條件下清除活性氧的能力，降低細胞受到的氧化損傷[7]。SA被認為是研究植物抵御脅迫的信號分子，因此研究水楊酸對Cd2+脅迫下細胞的影響，可以從細胞水平上揭示水楊酸對植物細胞抗重金屬脅迫的機制，對其應用于植物防御重金屬毒性有著重要意義。結構是功能的基礎，植物受重金屬脅迫后，在其細胞結構上的改變是植物一系列生理活動異常的細胞學基礎。為了開展這項研究，我們利用煙草膜泡運輸特征蛋白SCAMP2[8]與綠色熒光蛋白GFP進行基因重組并轉化植物模式細胞——煙草BY2細胞，獲得了膜泡熒光標記的BY2細胞。煙草BY2細胞作為一種模式植懸浮培養細胞開展的研究，具有均一性好、條件容易控制、培養周期短、重復性好等優點[9]，而用其進行重金屬鹽毒性的研究，可以直接從細胞水平來研究重金屬鹽對細胞的作用，避開了植株水平根吸收及輸運過程的影響。

1 材料和方法(Naterials and methods)

1.1 實驗材料

SCAMP2-GFP膜泡熒光標記的BY-2細胞由湖南農業大學細胞生物學實驗室提供。

1.2 實驗方法

將離心收集的BY-2細胞懸浮于MS培養基A中；將等量的BY-2細胞懸浮于含有0.068 mmol·L-1CdCl2的MS培養基B中(預實驗表明0.068 mmol·L-1為BY-2細胞在試驗周期中的半致死濃度)；將等量的BY-2細胞懸浮于含有0.068 mmol·L-1CdCl2與0.1 mmol·L-1SA的MS培養基C中(如表1)。把處理A、B和C同時置于120 r·min-1、26 ℃中培養，在3 h、6 h、9 h分別取樣進行細胞熒光觀察(10×20)。以及分別取出培養6 h的樣品進行激光共聚焦觀察(Confocal laser scanning microscope FV1000)。用移液器吸取少許細胞，滴在載玻片上，再用去離子水稀釋，利用移液器槍頭將細胞充分打散，再加蓋玻片后，顯微鏡下觀察照相。

2 結果與分析(Results and anslysis)

細胞熒光觀察實驗結果表明：當BY-2細胞培養至3 h的時候，可以發現對照組A和Cd-SA處理組C中細胞超微機構無明顯破壞，大多數細胞處于分裂前、中期；而Cd處理組B中少數細胞已經出現細胞核染色質凝集，核仁散開，核膜破裂，染色質從核孔散出，細胞皺縮和液泡縮小并出現導致細胞死亡的癥狀(圖1)。當BY-2細胞培養到6 h的時候，處理A、C中細胞的超微結構依然沒有明顯破壞，大多數細胞仍然處于分裂前、中期；而處理B中多數細胞已經進入細胞壞死狀態，其膜通透性增高，致使細胞腫脹，細胞器變形或腫大，最后細胞破裂(圖2)。當BY-2細胞培養到9 h的時候，處理A中細胞超微結構仍然沒有明顯破壞，細胞生長狀態良好；處理C中有個別細胞出現了細胞核染色質凝集，核仁散開等細胞死亡的癥狀，但仍然有不少處于正常分裂期的細胞；而處理B中極大多數細胞已經完全裂解，細胞開始分散，細胞間的黏附度下降，細胞呈現出不正常的生長狀態，在顯微鏡下只能看到少量分散熒光或者已經看不到任何熒光(圖3)。由圖4可知，處理B細胞的存活率呈現出明顯的下降趨勢，在9 h處存活率最低，下降幅度是最大的；培養基C細胞存活率下降度比培養基B細胞要低，并且在9 h處理C細胞存活率明顯要高于處理B細胞。

表1 細胞處理的配組

注：+為加入該物質處理，-為未加入該物質處理。

Note: + treatment; - without treatment.

圖1 熒光標記BY-2培養3 h處理后細胞形態Fig. 1 The cell morphology of the GFP labeled BY-2 after 3 h treatment

圖2 熒光標記BY-2培養6 h處理后細胞形態Fig. 2 The cell morphology of the GFP labeled BY-2 after 6 h treatment

細胞激光共聚焦實驗結果表明：當BY-2細胞培養到6 h的時候對照A中細胞的超微結構無明顯變化，質膜完整，細胞正常生長，形態良好；處理B中細胞出現和熒光顯微鏡觀察下相同的情況：大部分細胞體積異常增大，細胞分散腫脹，細胞器變形或腫大，細胞質膜破碎，細胞呈現出壞死狀態；處理C中大部分細胞超微結構無明顯變化，細胞體積正常，生長狀態良好，部分細胞高度液泡化，并且在細胞質膜上出現了明顯的熒光亮點。

圖3 熒光標記BY-2培養9 h處理后細胞形態Fig. 3 The cell morphology of the GFP labeled BY-2 after 9 h treatment

圖4 熒光標記BY-2水楊酸和Cd2+處理時間與細胞存活率柱形圖Fig. 4 The BY-2 survival chart after treatment of SA and Cd2+

3 討論(Discussion)

利用煙草膜泡綠色熒光蛋白GFP標記的BY-2細胞，結合當細胞受到重金屬Cd2+影響后在膜泡上熒光強度的大小，在單細胞或亞細胞水平上，研究外源SA在細胞水平與植物鎘耐性的相關性，可以很明顯的得出細胞熒光強度越強鎘的耐受性越大。

圖5 BY-2培養6 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察到熒光集中點Fig. 5 The fluorescence enclose are observed around the BY-2 membrane after 6 h SA-Cd treatmen t of the cell under the CLSM

通過對圖1、2、3分析發現，在重金屬Cd2+處理3 h，與對照組A相比較，水楊酸存在時鎘處理的Cd-SAC組中大部分細胞呈現出高度的液泡化，體積膨大明顯，并且絕大部分的細胞熒光亮度達到了最大值；而Cd處理的B組中大部分細胞除了體積膨大外也已呈現出皺縮的現象。在重金屬處理的6 h處，Cd-SA處理組大部分細胞仍保持體積膨大的狀態，且少部分細胞熒光亮度沒有減弱；而Cd處理的B組細胞則熒光亮度減弱，細胞皺縮現象加劇。在9 h處，Cd處理的B組細胞亮度降到了最低值，絕大部分細胞已皺縮死亡；Cd-SA處理的C組仍有部分細胞保持較大的體積和較強的熒光亮度。推測原因，細胞以高度液泡化的形式來抵御重金屬帶來的損傷。細胞通過高度液泡化來緩解重金屬的毒害作用，這與李春燁等[10]的實驗結果相一致，所以細胞體積膨大；另外，由于在外源SA的影響下，Cd-SA處理的C組細胞SCAMP2膜泡運輸蛋白數量增加，加大了對重金屬Cd2+的運輸，大大提高了熒光亮度和降低了重金屬的毒害作用，細胞死亡率有所降低。

通過圖4發現，在重金屬Cd2+脅迫6 h時，與對照組培養基A相比較，Cd-SA處理的C細胞呈現出更高程度的液泡化，并且只有Cd-SA處理的C組細胞膜上出現了高熒光顆粒(如圖5中箭頭方向所示)，與高電子密度顆粒一致，Liu和Kottkel[11]證實這些高電子密度顆粒中含有Cd2+。這說明細胞質中游離的Cd2+以細胞質膜包裹的形式進入細胞內，達到了減少胞外Cd2+的數量和降低對細胞帶來的傷害。另外，由圖4我們也可以發現，已有高熒光顆粒開始脫離細胞質膜進入細胞內部，說明在細胞質膜處形成了凹陷，Cd2+離子將會被膜泡包裹，然后脫離質膜，將重金屬隔離在特定部位，以減少破壞作用[12,13]。宇克莉等[14]證明，細胞液泡內含有各種的蛋白質、糖類等物質，能夠有效地與重金屬結合，并且液泡膜上存在轉運重金屬的H-ATP酶和Ca-ATP酶，從而降低重金屬的毒害作用。一般情況下，植物對于低濃度的重金屬脅迫通過其細胞壁的固定作用、質膜的選擇透過性和液泡的區室化作用可以產生一定的抵御能力。在重金屬脅迫下，細胞內部會形成數量不等的囊泡，包裹有重金屬的囊泡將會與液泡相融合，達到重金屬解毒的效果[15-16]。

SA作為一種小分子酚類化合物，在植物受到生物或非生物脅迫時，其生物活性會被激活，在抵御生物和非生物脅迫帶來的傷害。在受到重金屬脅迫后，植物內源SA水平升高，抗氧化系統酶類活性升高，熱激蛋白、PRP、RP、幾丁質酶等蛋白等防御基因表達活性提高，植物對重金屬脅迫的抵御能力提高[17]。通過施加外源SA有助于緩解重金屬的毒害作用，提高對非生物脅迫的抗性[18-20]。李豐濤[21]在研究鎘對紅麻根尖細胞結構的影響中發現，在不同濃度的Cd脅迫處理下，紅麻的根系活力明顯降低，根膜透性也有一定的上升，Cd對紅麻根系確實造成了損傷。另外還發現，在施加了外源的GSH且在較低濃度Cd脅迫時,細胞壁和細胞膜出現黑色沉積，Cd離子被阻隔在了原生質之外，保護了細胞。在本研究中同樣也發現了類似的情況。在Cd2+處理后，BY-2細胞出現質壁分離和原生質膜破裂現象，并且細胞器出現逐漸減少的現象，核膜、核仁解體而游離在胞質中。在進行Cd-SA處理后，細胞質膜周圍出現了包裹著重金屬離子的高電子密度顆粒，且細胞的存活率也較高，說明在外源SA的影響下，BY-2細胞內的重金屬Cd2+得到了有效的生物處理，減緩了這些超微結構的改變給細胞造成的不可逆的損傷。本研究得到的實驗結果與李豐濤在研究中施加外源GSH來緩解Cd對紅麻根尖細胞結構毒害作用的結果較為相似，為本研究中采用施加外源SA的研究方法提供了一定的知道思路。

本實驗研究表明，在重金屬Cd2+脅迫下，Cd-SA處理的細胞存活率較高，并由于其SCAMP2轉運蛋白的高生物活性，獲得了較高熒光亮度，并且在質膜處也發現了高電子密度顆粒，說明外源SA在協助細胞抵御重金屬脅迫中是有一定的促進效果的。

致謝：感謝植物激素及生長發育湖南省重點實驗室提供和協助進行掃描激光共聚焦觀察。

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Cadmium Toxicology to Cultured BY-2 Cells and the Relief Effects of Salicylic Acid to the Cadmium Toxicity

Zhang Mingxuan, Li Yingbang, Liu Aiyun, Zhang Xuewen*

College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

Received 30 October 2014 accepted 27 November 2014

The toxicity to immobilized plants is one of the most harmful effects of heavy mental cadmium to the ecological environment. In this paper the toxicity and mechanism of Cd2+to plants cells were analyzed by fluorescence microscope and confocal laser scanning microscope observation in GFP membrane labeled BY-2 cell. The relief effects of salicylic acid (SA) treatment to the Cd2+toxicity were also investigated. The results showed that the GFP fluorescence of the labeled cells was getting dimming after 3 h Cd2+treatment. The cells and vacuoles were apparently shrunk after 6 h. All the cells were dead after 9 h treatment. When SA was also added during the Cd2+treatment, the survival time of the treated cells were prolonged significantly. The SA and Cd2+treated cells also showed stronger fluorescence and better vacuolization compared to the Cd2+treatment. High fluorescence particles attached to the cell membrane were observed, indicating that there were wrapped Cd2+microcapsules formed in SA treatment cells. The results suggest that the SA treatment can relieve the toxicity of heavy metals both by high vacuolization in the cells and by membrane components retention of the heavy metals ion. The conclusion is that the microcapsule retention and vacuolization of the cells induced by SA is the mechanism of the SA toxicity relief.

cadmium; salicylic acid; GFP membrane labeled BY-2 cell; combined effect

湖南省教育廳一般項目(12C0156)

張明軒 (1989-), 男, 碩士研究生, 研究方向為分子細胞生物學, E-mail: 18684851879@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xwzhang@hunau.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20141030001

2014-10-30 錄用日期：2014-11-27

1673-5897(2015)3-224-06

Q247

A

張學文(1965-)，男，植物學博士，教授，主要從事細胞生物學教學與研究，發表論文50余篇。

張明軒, 李穎邦, 劉愛云, 等. Cd2+對BY-2細胞的毒性機制及水楊酸的緩解作用[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(3): 224-229

Zhang M X, Li Y B, Liu A Y, et al. Cadmium toxicology to cultured BY-2 Cells and the relief effects of salicylic acid to the cadmium toxicity [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 224-229 (in Chinese)