球形紅細菌降解RDX的動力學及其機理研究

白紅娟，王　珊，柴春鏡，牛偉平

(1. 中北大學化工與環(huán)境學院，山西太原030051；2. 北京航天計量測試技術(shù)研究所，北京100076；

3. 中北大學朔州校區(qū)化工與環(huán)境學院，山西朔州036000；4. 山西省農(nóng)藥檢定所，山西太原030001)

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球形紅細菌降解RDX的動力學及其機理研究

白紅娟1，王珊2，柴春鏡3，牛偉平4

(1. 中北大學化工與環(huán)境學院，山西太原030051；2. 北京航天計量測試技術(shù)研究所，北京100076；

3. 中北大學朔州校區(qū)化工與環(huán)境學院，山西朔州036000；4. 山西省農(nóng)藥檢定所，山西太原030001)

摘要：為了探索球形紅細菌對黑索今(RDX)的降解動力學及機理，研究了該菌株生長與降解RDX的關(guān)系，并對降解的動力學方程進行了擬合分析。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析了該菌株降解RDX的中間代謝產(chǎn)物，并推測了其可能的降解途徑。結(jié)果表明，RDX質(zhì)量濃度為2.5~30mg/L時，該菌株對RDX的降解符合一級動力學方程。培養(yǎng)4d時，用GC-MS檢測到兩種中間產(chǎn)物：六氫-1-亞硝基-3,5-二硝基-1,3,5-三嗪(MNX)和次甲基二硝胺(MEDINA)，其母離子的質(zhì)荷比(m/z)分別為207和135，其可能的降解途徑為：RDX首先還原為MNX，再進行一系列還原反應生成產(chǎn)物MEDINA，最終降解為小分子物質(zhì)，并認為硝基還原酶為該降解過程中的重要酶。

關(guān)鍵詞：球形紅細菌；光合細菌；黑索今；RDX；降解動力學；降解機理；MNX；MEDINA

引言

黑索今(RDX)廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)，因其具有顯著的生物毒性，美國環(huán)境保護署已將其列入優(yōu)先控制污染物名單[1]。國內(nèi)外處理RDX毒性的常用方法有光催化、吸附、超臨界水氧化以及微生物處理等[2-4]。物理化學方法一般僅適于濃度較高的有機廢水處理，對濃度較低的有機廢水處理效果差且成本高。生物降解具有成本低廉、無二次污染等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應用。盡管許多研究[5-10]表明RDX能被微生物降解，但其代謝途徑卻各不相同。Eaton H L等[6]用LC-MS/MS(APCI-)檢測到RDX的代謝產(chǎn)物六氫-1,3-二亞硝基-5-硝基-1,3,5三嗪(DNX)和六氫-1,3,5-三亞硝基-1,3,5三嗪(TNX)，但未檢測到次甲基二硝胺。Chen Yong等[9]用LC-MS/MS(APCI-)檢測到RDX的代謝產(chǎn)物MNX、二羥胺-硝基-1,3,5-三嗪和羥胺-二硝基-1,3,5-三嗪，但未檢測到DNX和TNX。Zhao J S等[10]用HPLC/UV分析了雙酶桿菌HAW-1代謝RDX的中間產(chǎn)物MNX、DNX和TNX。

光合細菌能在厭氧光照條件下進行不放氧光合作用，特別是紫色非硫細菌不僅能在厭氧光照的條件下進行光能異養(yǎng)生長，而且能在好氧黑暗條件下進行好氣異養(yǎng)生長。光合細菌這種隨著生存環(huán)境而靈活改變代謝類型的特性，較其他微生物材料具有優(yōu)越性[11]。本研究采用球形紅細菌降解RDX，探討了RDX的厭氧降解動力學和降解途徑，為該菌株在雜氮化合物廢水污染治理中的應用提供參考。

1實驗

1.1材料和儀器

菌種：球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides) H菌株系紫色非硫菌群紅細菌屬光合細菌, 由山西大學光合細菌研究室分離、鑒定并保存[11]；基礎(chǔ)培養(yǎng)基(酵母膏 1.0g、MgSO40.2g、CaCl20.07g、(NH4)2SO41.25g、蘋果酸 2.5g、KH2PO40.6g、K2HPO40.9g、蒸餾水1000mL, pH值7.0)；馴化培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基加適量RDX)。

日本日立公司CXTH-3000型高效液相色譜儀，分離柱為 HYPERHILBDH C18柱 (4.6mm×250mm, 5μm)，紫外檢測器檢測波長235nm，流動相為甲醇/水(體積比為50∶50)，流速 1.0mL/min, 進樣量10μL；美國Agilent公司HP5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，柱溫為80℃，以10℃/min升溫至280℃，恒溫2min，進樣口溫度為250℃，色譜-質(zhì)譜接口溫度為280℃，電子能量70eV，掃描范圍50~500m/z，選擇離子全掃描法，載氣為高純氦氣(99.999%)，流速為1.0mL/min。

1.2實驗方法

1.2.1菌種的馴化

將體積分數(shù)10%的原始菌液接入RDX質(zhì)量濃度為20mg/L的馴化培養(yǎng)基, 在30℃、2500 Lux光照度的培養(yǎng)箱中厭氧馴化培養(yǎng)4d作為馴化菌種。

1.2.2RDX降解培養(yǎng)基

將2g/L的RDX丙酮溶液過0.45μm濾膜除菌，取一定量置于滅菌的血清瓶中，待丙酮揮發(fā)完全后加入滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使RDX的最終質(zhì)量濃度達到實驗設(shè)計值。

1.2.3菌株生長與RDX降解動力學實驗

在無菌條件下, 將一定量馴化后的菌懸液在10000r/min下離心10min, 棄上清液，菌體用磷酸緩沖液洗滌2次后，用培養(yǎng)基制備成菌懸液備用。在RDX 質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、20、30 和40mg/L的降解培養(yǎng)基中，接種一定量的菌懸液(OD值為0.123)，分別調(diào)節(jié)pH值至6.5~ 7.0，在溫度30℃、厭氧光照條件(血清瓶裝滿培養(yǎng)物, 蓋橡皮塞；光照度為2500 Lux, 靜置)培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7d后以10000r/min離心菌體10min，測定上清液中剩余RDX的質(zhì)量濃度，考察菌種對不同質(zhì)量濃度RDX的降解動力學。用等量蒸餾水制備的菌懸液，于波長680nm處測定OD值，以測定其生物量。同時，用不加菌體和接種滅活的死菌體的樣品作對照，每個條件做2個平行樣本，重復實驗3次。

1.2.4降解RDX菌株粗酶液的制備

參考文獻[13]制備粗酶液。將已培養(yǎng)好的菌液以10000r/min離心10min，棄上清液，菌體用0.1mol/L、pH值7.5的磷酸緩沖溶液洗滌2次，懸浮于1mL的磷酸緩沖溶液中，然后樣品在冰浴中用頻率50Hz超聲波破碎10次(每次間隔30s超聲10s)，細胞破碎液于4℃再以12000r/min離心10min，棄沉淀，上清液即為粗酶液。

1.3測試方法

用紫外可見分光光度計在最大吸收波長680nm 處測定菌液濃度。

用高效液相色譜法測定RDX的質(zhì)量濃度。20mg/L的RDX經(jīng)球形紅細菌降解4d后取樣，經(jīng)過高速離心(10000r/min，10min)后收集上清液，經(jīng)0.2μm 微孔濾膜過濾除菌后，用30mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，用2g無水Na2SO4干燥，在35℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，甲醇定容至2mL細胞瓶，用GC-MS進樣分析。

用考馬斯亮藍比色法測定粗酶液中總蛋白質(zhì)含量[14]。硝基還原酶活性的測定參考文獻[15]，反應混合物包括：6.5~8.5mg 蛋白/mL，20mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH值7.4)，0.09mmol/L RDX (二甲基甲酰胺溶劑，體積分數(shù)2%)，0.5mmol/L NADPH。混合物在37℃下反應4h, 然后放置于冰浴，并加入1mL ZnSO4(質(zhì)量分數(shù)15%)終止反應。反應后的混合物中加入1.0g NaCl和4.0mL乙酸乙酯萃取殘留的RDX，濃縮有機層，用0.5mL甲醇定容。以每分鐘消耗1μmol RDX所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。

2結(jié)果與討論

2.1H菌株生長與降解RDX的關(guān)系

球形紅細菌H菌株在RDX(初始質(zhì)量濃度為20mg/L)培養(yǎng)基中的生長情況及其與RDX降解的關(guān)系見圖1。

圖1　降解時間與細菌生長量及RDX質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線Fig.1　The relation curves between the growth ofRhodobacter sphaeroides, the mass concentration of RDXand RDX degradation time

從圖1可以看出，當降解2d時，RDX質(zhì)量濃度為12.9mg/L，RDX的去除率為32.8%；當降解4d 時，RDX質(zhì)量濃度迅速降低為4.2mg/L，去除率達到78.0%；當降解5d 時，RDX質(zhì)量濃度明顯降低為2.2mg/L，去除率達到88.6%。可見菌株的生長曲線與RDX的降解曲線具有一定的一致性，隨著菌株進入對數(shù)生長期(3~5d) ，RDX的降解效率顯著升高;之后隨著時間的增加，由于營養(yǎng)成分的缺失和代謝物的增加，菌株生長逐漸至衰退期，對RDX的降解能力也隨之下降，降解曲線趨于平緩。當降解7d時，用降解菌降解RDX(初始質(zhì)量濃度為20mg/L)培養(yǎng)液，未檢測到RDX；而不加菌的空白對照液中，RDX的7d自然降解率僅為3.1%，接種死菌體對照液中，RDX的7d吸附率僅為2.3%，表明RDX的降解過程是生物酶的作用過程。因此，菌體降解RDX與菌體的生長指數(shù)期有關(guān)。

2.2H菌株對不同質(zhì)量濃度RDX的降解動力學

將降解試驗數(shù)據(jù)進行一級動力學和二級動力學模擬，見式(1)和式(2)：

C=C0e-k1t

(1)

1/C=1/C0+k2t

(2)

式中：k1為一級反應速率常數(shù)，d-1；k2為二級反應速率常數(shù)，L/(mg·d)；t為反應時間，h;C、C0分別為t時間和初始時的底物濃度，mg/L。

H菌株對不同質(zhì)量濃度RDX降解的動力學參數(shù)如表1所示。由表1可看出本試驗條件下的模擬結(jié)果，降解動力學在一定程度上較符合一級動力學特征；RDX質(zhì)量濃度為2.5~30.0mg/L時，k1較大，半衰期t1/2較短，均小于2.5d；RDX質(zhì)量濃度為5.0mg/L時，k1最大，t1/2僅為1.3d；RDX質(zhì)量濃度為30.0mg/L時，k1降低，t1/2增至2.2d；RDX質(zhì)量濃度為40.0mg/L時，降解效果出現(xiàn)明顯下降，k1迅速降至0.092d-1。結(jié)果也表明，在RDX的生物降解過程中，RDX既是反應的基質(zhì)，同時也是抑制劑。

表1　H菌株對不同質(zhì)量濃度RDX降解的動力學參數(shù)

注：ρ(RDX)為RDX的初始質(zhì)量濃度；k1為一級反應速率常數(shù)；k2為二級反應速率常數(shù)；t1/2為半衰期；R2為相關(guān)系數(shù)。

2.3H菌株降解RDX的中間產(chǎn)物及途徑分析

2.3.1中間產(chǎn)物的GC-MS分析

為探討H菌株對RDX的降解動態(tài)過程及其降解產(chǎn)物，在降解反應完成后，將其體系中各組分用GC-MS進行檢測分析，結(jié)果見圖2。研究結(jié)果表明, 隨著降解的進行，各種物質(zhì)呈現(xiàn)動態(tài)變化，底物及各種不同中間產(chǎn)物均表現(xiàn)出有序的產(chǎn)生和消失規(guī)律。從圖2可以看出，物質(zhì)A的出峰時間為16.1min，當其被H菌株降解3d后, 其峰高比未降解處理的峰高降低了大約60%，同時出現(xiàn)了1個較大的峰(出峰時間13.2min)和1個小峰(出峰時間4.3min)，形成的主要中間產(chǎn)物B和C；當降解4d時，物質(zhì)A的峰高比未降解處理時明顯降低了78%，中間產(chǎn)物B和C的峰高比降解3d分別降低了40%和24%；當降解7d時, 物質(zhì)A、中間產(chǎn)物B和C的峰均已消失，表明物質(zhì)A及其中間產(chǎn)物已經(jīng)降解完全。

圖2　不同降解時間下球形紅細菌降解RDX代謝產(chǎn)物的GC-MS圖譜Fig.2　GC-MS spectra of metabolites during RDX degradationby Rhodobacter sphaeroides with different degradation times

通過與數(shù)據(jù)庫譜圖的比對分析物質(zhì)A、中間代謝產(chǎn)物B和C的質(zhì)譜圖，其對應母離子、離子碎片及其質(zhì)核比(m/z)見表2。3種主要物質(zhì)分別為RDX、六氫-1-亞硝基-3,5-二硝基-1,3,5三嗪 (MNX)和次甲基二硝胺(MEDINA)。保留時間為16.1min，母離子的m/z為223，物質(zhì)A為RDX；保留時間為13.2min，母離子的m/z為207，中間代謝產(chǎn)物B為MNX；保留時間為4.3min，母離子[MEDINA-H]+的m/z為135，中間代謝產(chǎn)物C為MEDINA。本實驗檢測到RDX的2種代謝中間產(chǎn)物與文獻[8]報道的一致。

表2　球形紅細菌降解RDX代謝過程中代謝產(chǎn)物的GC-MS分析結(jié)果

2.3.2H菌株降解RDX的機理分析

為探討H菌株降解RDX的機理，通過測定微生物代謝產(chǎn)物分析其降解代謝途徑，見圖3。

圖3　球形紅細菌對RDX降解的厭氧生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.3　The anaerobic biotransformation pathway of RDXdegradation by Rhodobacter sphaeroides

2.4RDX質(zhì)量濃度對菌體細胞中硝基還原酶活力的影響

不同質(zhì)量濃度RDX對H菌株產(chǎn)生硝基還原酶活力的影響如表3所示。由表3可見，在低質(zhì)量濃度RDX的培養(yǎng)液中，H菌株產(chǎn)生的硝基還原酶比活力與對照組相比有一定程度升高；在RDX(質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0mg/L)作用下，其比活力較對照組分別增加了21.4%、41.4%、27.3%、6.5%。而隨著培養(yǎng)液中RDX質(zhì)量濃度的提高，其比活力受到抑制；當培養(yǎng)液中RDX降解質(zhì)量濃度達到30.0mg/L時，相比對照組，其比活力下降了17.9 %。

表3　RDX質(zhì)量濃度對H菌株產(chǎn)生硝基還原酶的影響

注：ρ(RDX)為RDX初始質(zhì)量濃度；m為總蛋白質(zhì)量；KA為總酶活；RKA為比活力。

3結(jié)論

(1)球形紅細菌降解RDX與菌體的生長指數(shù)期有關(guān)；RDX質(zhì)量濃度為2.5~30.0mg/L時，降解動力學較符合一級動力學特征，半衰期均小于2.5d。

(2)在球形紅細菌降解RDX的過程中，出現(xiàn)了兩種中間產(chǎn)物MNX和MEDINA，推測其可能的降解途徑為RDX首先還原為MNX，再進行一系列還原反應生成產(chǎn)物MEDINA，最終礦化為小分子。

(3)硝基還原酶為該降解過程中的重要酶，RDX質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0mg/L時，其比活力比對照組分別增加了21.4%、41.4%、27.3%、6.5%；而隨著培養(yǎng)液中RDX質(zhì)量濃度提高到30.0mg/L，其比活力受到抑制。

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Study on Degradation Kinetics and Mechanism of Explosive

Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX) by Rhodobacter Sphaeroides

BAI Hong-juan1, WANG Shan2, CHAI Chun-jing3, NIU Wei-ping4

(1. School of Chemical Engineering and Environment, North University of China, Taiyuan 030051, China；

2. Beijing Aerospace Institute for Metrology and Measurement Technology, Beijing 100076, China；

3. School of Chemical Engineering and Environment, North University of China, Shuozhou Shanxi 036000, China；

4. Institute for the Control of Agrochemicals Shanxi, Taiyuan 030001, China)

Abstract:To explore the degradation kinetics and mechanism of explosive hexahydro-1, 3, 5-trinitro-1, 3, 5-triazine (RDX) by Rhodobacter sphaeroides, the relationship between the growth of Rhodobacter sphaeroides and RDX degradation was studied, and the fitting analysis of the degradation kinetic equation of RDX was performed. The intermediates of RDX metabolized by the strain were analyzed by gas chromatograph-mass spectrometer(GC-MS), and the possible pathway of RDX degradation was deduced. The results show that the RDX degradation by the strain is in accordance with the first-order kinetic model for RDX with initial mass concentration of 2.5-30mg/L. Cultivating for 4d, two intermediates hexahydro-1-nitroso-3,5-dinitro-1,3,5-triazine (MNX) and methylenedinitramine(MEDINA) were detected by GC-MS, and the ratios of mass to charge(m/z)of its parention were 207 and 135, respectively. The possible degradation pathway is that RDX is first reduced to MNX and the latter undergoes further reduction to finally produce MEDINA, which was finally degraded to smaller molecular compounds, considering that nitro reductase is an important enzyme in the degradation process.

Keywords:Rhodobacter sphaeroides; photosynthetic bacteria; hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine; RDX; degradation kinetics; degradation mechanism; MNX; MEDINA

作者簡介:白紅娟(1969-)，女，教授，從事環(huán)境微生物技術(shù)研究。

基金項目:山西省科技攻關(guān)資助項目(20080311027-1)；中北大學自然科學基金項目資助

收稿日期:2015-08-04；修回日期:2015-10-13

中圖分類號：TJ55; X93

文獻標志碼：A

文章編號：1007-7812(2015)06-0051-05

DOI：10.14077/j.issn.1007-7812.2015.06.010