牡蠣幼蟲光照實驗提示復雜遺傳背景下基因互作的多樣性*

徐彩麗 許 飛 王 嬌 武長路 于文超 王曉通①

(1. 魯東大學農學院 煙臺 264025; 2. 中國科學院海洋研究所 青島 266071)

長牡蠣(Crassostrea gigas)在系統分類學上屬軟體動物門、雙殼綱、牡蠣目、牡蠣科、巨蠣屬, 味道鮮美, 營養價值高, 是人們喜食的海產佳肴, 素有“海中牛奶”之稱, 是一種適合我國沿海養殖的優良品種, 經濟效益顯著, 現已成為我國重要的海水養殖品種(毛玉澤等, 2005)。很多研究表明, 葡萄牙牡蠣(Crassostrea angulata)也屬于軟體動物門、雙殼綱、牡蠣目、牡蠣科、巨蠣屬, 是長牡蠣的亞種, 在我國以長江為界, 主要分布在南方沿海, 在外形和生活習性方面與長牡蠣具有一定差異。

相對于品種之間, 亞種之間的遺傳背景差距更大, 但已有證據表明兩種牡蠣在自然條件下可以雜交, 且雜交后代具有正常的有絲分裂和減數分裂, 并且具有一定雜種優勢(Soletchnik et al, 2002; Batista et al, 2007; 鄭懷平等, 2012)。光照是水產養殖環境中的一項重要因素, 對于水產動物的生理狀態具有一定影響, 曾有學者在室內試驗條件下研究了光照對硬殼蛤稚貝的潛砂活動的影響, 結果顯示光照對其潛砂活動有顯著影響, 光照強度的增加能提高稚貝潛砂的比例(王國棟等, 2008); 還有學者觀察到, 在有光照的情況下, 泥下蝸牛的攝食量會減少, 這與它一直生活在泥下環境的習性相一致(Magalh?es et al,2012); 但光照對于牡蠣幼蟲生長速度和成活率方面的研究還很少, 長牡蠣與葡萄牙牡蠣雜交幼蟲對不同光照梯度的反應, 還未見報道。另外, 在牡蠣的育苗實踐中, 大家仍未確定合適的光照強度, 還需要更多的實驗證據。

本研究通過觀察比較不同光照強度下長牡蠣幼蟲及長牡蠣與葡萄牙牡蠣雜交幼蟲殼高和成活率的差異, 揭示光照是否對牡蠣幼蟲早期的生長成活率有影響、雜交牡蠣幼蟲是否在這個時期是否表現出雜種優勢, 為牡蠣幼蟲的培養和雜交育種提供有參考數據。同時由于本研究中雜交牡蠣幼蟲的父母本遺傳背景差異較大, 而牡蠣本身的雜合度也很高, 基因互作的多樣性是否會體現為雜交幼蟲表型上的多樣性,也需要進一步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

長牡蠣采自山東乳山, 葡萄牙牡蠣采自福建莆田, 殼高均為8cm左右, 將牡蠣殼表面清洗干凈, 放在育苗池中暫養。

1.2 實驗儀器

主要包括充氣泵、照度計、顯微鏡、水桶、光源、螺絲刀、洗瓶、燒杯、胚胎觀察皿、碘酊等。

1.3 牡蠣雌雄的鑒別

用牡蠣刀將暫養 3d后的牡蠣的閉殼肌割斷, 撬掉其右殼, 用消過毒的牙簽在其性腺部位扎一下, 然后將牙簽在事先準備好的滴在載玻片上的一滴清水中搖晃幾下, 之后將載玻片放在顯微鏡下觀察, 辨別牡蠣的性別。

1.4 受精

分別挑選出雄性長牡蠣、雌性長牡蠣和雌性葡萄牙牡蠣, 用牙簽分別劃破三種牡蠣性腺表皮, 動作要輕, 注意不要劃破內臟團, 然后用洗瓶沖洗長牡蠣的精子長牡蠣卵子、葡萄牙牡蠣的卵子, 并分別收集于三個水桶內, 將長牡蠣的卵子和葡萄牙牡蠣的卵子中分別放入十分之一體積的精子, 使其結合受精,30min左右便可觀察受精情況, 根據觀察結果判斷是否補加精子或洗卵, 培養22h左右至受精卵發育為D型幼蟲。

1.5 光照梯度設置與幼蟲養殖

將水箱中培養的幼蟲搖勻后, 用1000mL的燒杯盛取500mL含有幼蟲的海水, 實驗設置3個生物學重復, 長牡蠣幼蟲分別記為 GG1、GG2、GG3; 雜交幼蟲分別記為GA1、GA2、GA3; 本實驗共設置6個梯度, 分別為269、58、15、4、1.5和0 lx, 光照時間是每天早 8點至晚 8點, 共 12h; 裝有長牡蠣幼蟲的燒杯分別記為 GG1-1, GG1-2, ··, GG1-6; GG2-1, GG2-2, ··,GG2-6; GG3-1, GG3-2, ··, GG3-6; 裝有雜交幼蟲的燒 杯 分 別 記 為 GA1-1, GA1-2, ··, GA1-6; GA2-1,GA2-2, ··, GA2-6; GA3-1, GA3-2, ··, GA3-6; 將燒杯中的幼蟲從 1日齡飼養到 10日齡, 每天用塑料吸管吸取1mL的小球藻喂養, 每天喂2次, 培養到10日齡, 即殼頂期幼蟲期。

1.6 測量及數據統計

殼高的測量: 配合目鏡測微尺和鏡臺測微尺進行殼高的測量, 選用帶有刻度的塑料吸管吸取 1mL海水, 擠到胚胎觀察皿中, 滴加一滴碘酊以免牡蠣幼蟲移動而影響讀數, 每個燒杯讀30個樣, 取均值。

成活率的計算: 用帶刻度的塑料吸管分別在初始燒杯內吸取 1mL含有幼蟲的海水, 擠到胚胎觀察皿中, 滴加一滴碘酊以免牡蠣幼蟲移動而影響讀數,在顯微鏡下計算幼蟲個數, 測三次取平均值, 然后再乘上燒杯中液體的體積, 即是燒杯中幼蟲的初始總個數; 到第10天時, 按照同樣的方法計算出第10天每個燒杯中幼蟲的個數, 第 10天燒杯中幼蟲的總個數與燒杯中幼蟲的初始總個數的比值即為成活率;取樣之前, 用塑料吸管多次吹打燒杯中的海水, 從而保證幼蟲分布均勻。

1.7 數據分析與統計

使用 SAS軟件的單因素最小二乘分析(GLM)對實驗數據進行統計分析, 利用R軟件的heatmap和pca程序對各家系進行聚類分析和主成分分析并制圖。

2 結果

2.1 長牡蠣及雜交各家系幼蟲在不同光照強度下的生長與成活情況

不同光照強度對長牡蠣和雜交牡蠣各家系的影響見表1和表2, 通過SAS軟件的單因素最小二乘分析, 發現是長牡蠣各家系還是雜交牡蠣各家系, 各個光照梯度下第 10天的殼高均沒有顯著差異(P＞0.05),而長牡蠣幼蟲和雜交牡蠣幼蟲均58 lx的光照強度下,表現出最高的成活率(卡方檢驗, P＜0.05)。

2.2 不同光照強度對長牡蠣及雜交牡蠣各家系幼蟲生長成活率影響的比較

將長牡蠣幼蟲和雜交牡蠣幼蟲在不同光照梯度下的殼高和成活率分別進行比較, 如圖1和圖2所示,長牡蠣幼蟲和雜交牡蠣幼蟲在各個光照梯度下的殼高均沒有顯著差異(P＜0.05), 但雜交牡蠣幼蟲的成活率在269 lx和58 lx兩個光照梯度下均極顯著的高于長牡蠣幼蟲(P＜0.01)。

表1 不同光照強度對長牡蠣生長和成活率的影響Tab.1 The shell height and survival rate of the Pacific oyster larvae under different illuminance levels

表2 不同光照強度對雜交牡蠣生長和成活率的影響Tab.2 The shell height and survival rate of the hybrid larvae from Pacific oyster and Portuguese oyster under different illuminance levels

圖1 不同光照強度對長牡蠣及雜交牡蠣各家系幼蟲生長速度影響的比較Fig.1 Comparison of the shell height between the Pacific oyster and the hybrid larvae from Pacific oyster and Portuguese oyster under different illuminance levels

圖2 不同光照強度對長牡蠣及雜交牡蠣各家系幼蟲成活率影響的比較Fig.2 Comparison of the survival rate between the Pacific oyster and the hybrid larvae from Pacific oyster and Portuguese oyster under different illuminance levels

2.3 幼蟲殼高與成活率相關性分析

為了驗證是否因為餌料不足而造成殼高與成活率之間負相關, 我們將長牡蠣與雜交牡蠣的殼高與成活率合并在一起, 進行了相關性分析。如圖3所示,R2=0.08遠遠小于 1, 表明殼高與成活率之間沒有相關性, 殼高與成活率這兩個指標各自獨立, 不會對本文的分析結果造成不良影響。

圖3 幼蟲殼高與成活率相關性分析Fig.3 Correlation analysis of the shell height and the survival rate in all larvae

2.4 不同光照強度對同一母本的長牡蠣幼蟲和雜交幼蟲生長發育影響的比較

根據不同光照梯度下的殼高和成活率共12個指標, 對長牡蠣幼蟲 3個家系(GG1、GG2、GG3)和雜交牡蠣幼蟲 3個家系(GA1、GA2、GA3)進行聚類分析和主成分分析, 其中GG1與GA1家系來源于同一個雌牡蠣, GG2與 GA2家系來源于同一個雌牡蠣,GG3與GA3家系來源于同一個雌牡蠣。如聚類結果圖4所示, 長牡蠣家系聚在一個大支上, 而雜交牡蠣家系GA1、GA2、GA3不能聚在一起, GA3位于長牡蠣家系的大支上, 而GA2、GA3分別位于不同的大支,且相隔距離較遠。為了更形象地展示各個家系之間的差異, 作者又進行了主成分分析, 如圖 5所示, 長牡蠣幼蟲 3個家系(GG1、GG2、GG3)非常清晰的聚在一起, 相互之間間距不大, 而雜交牡蠣幼蟲3個家系(GA1、GA2、GA3)很明顯的分在三個方向, 相互之間間距都很大, 有意思的是, GG1與 GA1之間的距離、GG2與GA2之間的距離、GG3與GA3之間的距離都比較小, 這應該是因為母本是同一只牡蠣的原因。

圖4 不同光照強度對長牡蠣及雜交牡蠣各家系幼蟲生長成活率影響的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of the shell height and the survival rate of the Pacific oyster and the hybrid larvae from Pacific oyster and Portuguese oyster under different illuminance levels

圖5 不同光照強度對長牡蠣及雜交牡蠣各家系幼蟲生長成活率影響的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of the shell height and the survival rate of the Pacific oyster and the hybrid larvae from Pacific oyster and Portuguese oyster under different illuminance levels

3 討論

光照是水產養殖環境中的一項重要因素, 光照強度對水生動物生長、發育及成活率的影響光照強度對水生動物生長的影響因種而異, 既能促進也能抑制(周顯青等, 1999, 2000)。北極紅點鮭(Satvetinus alpinus)幼體在50 lx時生長最快, 死亡率較低, 高于或低于此值的光照強度都會使生長速度減慢(Minagawa, 1994)。在本實驗當中也有類似結果, 作者發現光照在0—269 lx范圍內變化對牡蠣幼蟲的生長沒有顯著影響, 但長牡蠣幼蟲和雜交牡蠣幼蟲均在58 lx的光照強度下, 表現出最高的成活率, 說明在牡蠣育苗的前10天如果保持這樣的光照強度則對生產有利, 長牡蠣幼蟲和雜交牡蠣幼蟲的這種相似性,也支持葡萄牙牡蠣與長牡蠣是一個物種的觀點(Wang et al, 2010; 林清等, 2014)。而雜交牡蠣幼蟲在269 lx和58 lx兩個光照梯度下的成活率均極顯著的高于長牡蠣幼蟲, 提示雜交牡蠣幼蟲在這兩個光照強度下表現出了雜種優勢, 或許是因為長牡蠣與葡萄牙牡蠣的遺傳背景具有較大差異但還沒有產生生殖隔離,正好符合雜種優勢產生的遺傳條件(胡建廣等, 1999;林建麗等, 2009)。

以不同光照梯度下殼高和成活率作為指標進行聚類分析和主成分分析后發現, 雜交牡蠣幼蟲具有靠近各自同母本長牡蠣幼蟲的趨勢, 說明同一母本遺傳背景在性狀表現上啟到了一定作用。但更有意思的是, 長牡蠣幼蟲各家系間的表型比較接近, 而雜交牡蠣幼蟲各家系之間差異非常大, 如果僅僅考慮基因序列的相似度, 3個雜交牡蠣幼蟲的表型應該比較接近, 也應該聚在一起, 但事實是雜交幼蟲表型的差異非常大, 作者推測是基因互作在雜交牡蠣的表型分化上發揮了重要作用, 牡蠣基因組的高雜合性(Zhang et al, 2012)使得長牡蠣和葡萄牙牡蠣各自儲備了豐富的等位基因, 同時由于地理分布上的隔離,長牡蠣和葡萄牙儲備的等位基因并不相同, 當兩者雜交時, 兩個亞種的不同基因座位的不同等位基因進入到了同一個個體中, 從而發生了亞種內很難發生的基因互作, 由于等位基因很豐富, 因此互作組合的類型也很多, 從而導致了表型的多樣性。曾有學者發現雜交種在雜合狀態下能夠激發某種機制, 表達出與父母本均不同的新的基因產物, 調控相關的各種生理生化反應, 從而表現出雜種優勢(王章奎等,2003; Baranwal et al, 2012; Fujimoto et al, 2012;Meyer et al, 2012), 本研究的發現也可以這樣來解釋,只是雜種優勢的方向可能是多樣化的。當然, 該推測還需更多的實驗證據, 比如, 可以測定各組幼蟲的轉錄組, 觀察其對光照的反應模式是否與基因表達模式一致, 這是在今后研究中需要考慮的問題。

4 結論

根據長牡蠣及同母本雜交牡蠣幼蟲對光照的不同反應, 作者認為, 58 lx的光照強度對前10天的牡蠣育苗生產有利; 葡萄牙牡蠣與長牡蠣的雜交是可行的, 在幼蟲階段就已經表現出了雜種優勢; 具有高雜合度基因組并且遺傳背景差異較大群體雜交一代表型的巨大差異可能由于基因互作組合多樣化而引起。

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