澳洲茄堿和澳洲茄胺抑制肺癌細胞的構效比較*

澳洲茄堿和澳洲茄胺抑制肺癌細胞的構效比較*

★陳來1*第一作者：陳來(1976—)，男，講師，博士。研究方向：生物醫藥。E-mail：385907358@qq.com。郭權1金德忠1,2張潔1李姍姍1黃云1羅小泉1(1.江西中醫藥大學南昌 330004；2.南昌大學南昌 330000)

摘要：目的：探討澳洲茄堿及其水解苷元澳洲茄胺對肺癌細胞抑制的構效關系。方法：MTT法檢測澳洲茄堿及澳洲茄胺對A549和LLC細胞抑制作用；以20μg/mL的澳洲茄堿和8μg/mL澳洲茄胺分別處理A549細胞24h，觀察細胞形態，并經定量PCR檢測p53靶基因Bax和Puma表達水平。結果：對A549和LLC細胞，澳洲茄胺的24h IC50大約都為7.5μg/mL，澳洲茄堿的大約都為19μg/mL。形態學觀察表明澳洲茄胺和澳洲茄堿處理的A549細胞都呈現細胞膜皺縮的垂死形態。定量PCR數據顯示，與溶媒相比澳洲茄堿及澳洲茄胺都顯著提高了p53通路Puma基因表達水平(P<0.001和P<0.05)。結論：澳洲茄堿及澳洲茄胺對癌細胞抑制量效模式相同，有效部位是苷元，作用機制是誘導細胞死亡，分子機制可能是通過上調Puma表達而激活p53信號通路。

關鍵詞：澳洲茄堿；澳洲茄胺；肺癌；構效

龍葵全草均可入藥,其生物活性成分主要包括甾體類生物堿、多糖、維生素A和維生素C等；其中,甾體類生物堿具有抗腫瘤活性[1]；又以澳洲茄堿能以誘導細胞凋亡和/或壞死的方式顯著抑制肺癌細胞[2]等腫瘤的生長，但其起作用的主要有效基團及其分子機制尚需進一步探討。澳洲茄堿的水解苷元是澳洲茄胺[3]。本課題從半致死劑量、細胞形態和p53信號通路[4]的影響等方面比較澳洲茄堿與澳洲茄胺對相同肺癌細胞的抑制作用，以探討前體及其水解苷元之間的構效關系，從而揭示澳洲茄堿和澳洲茄胺抑制肺癌細胞的主要基團及其分子機制。

1材料與儀器

1.1試劑與儀器鏈霉素、青霉素、MTT粉末、胰蛋白酶、多聚賴氨酸均購自Sigma公司，DMEM購自Hyclone公司，胎牛血清購自GIBCO公司，10cm、6cm培養皿、96孔板購自NORMAX公司；BINDER CO2培養箱，Nikon ECLIPSE TS100倒置光學顯微鏡，VARIOSKAN FLASH酶標儀(Thermo SCIENTIFIC公司)，超聲波細胞破碎儀(JY92-II型號，南京先敏儀器制造有限公司)，Roche反轉錄試劑盒(Roche)，LightCycler?96 SW 1.1序列檢測系統(Roche)。

澳洲茄胺、澳洲茄堿的提取與純化方法參考文獻[3]，最終獲得HPLC級濃度分別為94.5%和97.5%的粉末。

1.2細胞人類肺癌A549、小鼠Lewis肺癌LLC細胞株由南京大學模式動物研究所劉耕老師實驗室提供。細胞以含10%FBS及1萬單位/mL雙抗的DMEM全培養基培養于0.5%CO2、37℃及90%左右濕度的CO2培養箱中。

1.3藥物溶液的制備

1.3.1澳洲茄堿的均一溶液的制備參考文獻[3]。稱取50mg用DMSO溶解成濃度為44.5mg/mL的均一溶液，置于4℃冰箱避光保存、備用。

1.3.2均一澳洲茄胺醇溶液的制備。稱取20mg澳洲茄胺加入5mL無水乙醇，用超聲波以最大功率的17%(300瓦)超聲處理1s、停2s，共處理2.8min，混懸液變得均一，但仍有肉眼勉強可視的顆粒，再加入5mL無水乙醇，經振蕩處理2min后顆粒完全溶解，從而獲得濃度為2000μg/mL的均一醇溶液，置于4℃冰箱避光保存、備用。

J.澳洲茄堿，a.澳洲茄胺

2方法與結果

2.1MTT法檢測和比較澳洲茄胺和澳洲茄堿對肺癌細胞的抑制作用細胞以2000個/孔鋪至96孔板內，空白對照、加溶媒組、加藥組(澳洲茄胺從0.625、1.25、2.5、5、10到20μg/mL；澳洲茄堿從5、10、20、40、60到80μg/mL，共6個梯度)各重復5個孔，共2～3板。以100μLDMEM全培養基培養20小時后，分別換成200μL空白、含溶媒或各濃度澳洲茄胺和澳洲茄堿的DMEM全培養基，24、48、72h后各取一96孔板，吸去培養基并加入200μL含5mg/mL MTT(溶于1×PBS并過濾)的新鮮DMEM全培養基，CO2培養箱中繼續培養4h。小心吸去培養液，加入150μLDMSO搖床搖5min，用酶標儀振蕩20s后測各孔OD492的值。每板細胞中同一細胞的各濃度藥物的抑瘤率按下面公式計算：

抑瘤率=1-(藥物組OD492-空白組OD492)/(溶媒組OD492-空白組OD492)×100%

結果見圖1。從結果來看，基本上澳洲茄胺和澳洲茄堿對兩種惡性肺癌細胞的抑制呈現與濃度成正相關的趨勢，并可以容易得出澳洲茄胺對A549、LLC細胞處理24h的IC50分別皆為約7.5μg/mL；而澳洲茄堿對A549和LLC細胞處理24h的IC50均約為19μg/mL。

2.2細胞形態觀察比較實驗過程參考文獻[2]。A549細胞以0.8×106/皿的密度鋪到6cm培養皿中，DMEM全培養基培養20h后，再加入澳洲茄胺(用DMEM全培養基稀釋至終濃度為8μg/mL)及其溶媒無水乙醇(終濃度為0.4%v/v)，或澳洲茄堿(用DMEM全培養基稀釋至終濃度為20μg/mL)及其溶媒DMSO(終濃度為0.045%v/v)處理24h細胞，用Nikon倒置顯微鏡，明場40×10倍觀察細胞形態并攝像稍高于半致死劑量的澳洲茄胺處理過的肺癌細胞呈現細胞膜皺縮的垂死形態，而無水乙醇處理的細胞則形態飽滿、細胞膜完整、圓潤。澳洲茄堿及其溶媒處理的細胞也觀察到分別與澳洲茄胺及其溶媒處理細胞相同的情形及文獻[2]，結果見圖2。

圖28μg/mL澳洲茄胺及乙醇，或20μg/mL澳洲茄堿及DMSO處理24h后的A549細胞形態比較，比例尺：200μm。

圖38μg/mL澳洲茄胺及乙醇，或20μg/mL澳洲茄堿及DMSO處理24h后的A549細胞中p53通路下游各基因表達情況比較。*P<0.05，有顯著性差異；***P<0.001，有極顯著性差異；N.S：P≥0.05，無顯著性差異。

3構效分析與討論

比較澳洲茄胺與澳洲茄堿對相同的兩種肺癌細胞的抑制效果，可以看到，兩種藥物對同一種肺癌細胞的抑制效果不管從時間依賴還是從濃度依賴來看，走勢都很接近，提示這兩種藥物對同種肺癌細胞存在相似作用模式，這一點可以從藥物作用后的細胞形態變化(圖2)和激活相同的信號通路(圖3)獲得支持；而兩種藥物的IC50值則分別為7.5μg/mL左右和19μg/mL左右，后者將為前者的2.5倍多一點。比較澳洲茄堿和澳洲茄胺的分子結構，可以看到，澳洲茄胺只是澳洲茄堿的苷元部分[3]，這就表明，澳洲茄胺和澳洲茄堿起相同抑制腫瘤生長效果的分子基團應該就是它們共有的苷元部分，而且前者效果是后者的兩倍還多。考慮到澳洲茄胺的分子量為413.62，而澳洲茄堿的分子量為884.06，后者是前者的2倍多，這就說明澳洲茄堿水解成澳洲茄胺之后，相同質量的兩種藥物分子中有效苷元成分后者是前者的2.1倍多，再考慮到兩者純度上的差異(后者為94.5%，前者為97.5%)，這就與澳洲茄胺抑制肺癌細胞的IC50值是澳洲茄堿的約2.5倍相一致，因此，從分子量的比較來看，也驗證了苷元部分是澳洲茄胺和澳洲茄堿抑制肺癌細胞生長的有效分子基團這一推論，不難理解，澳洲茄堿結構中的非苷元部分在對肺癌細胞生長并不起主要的作用。因此，澳洲茄堿的水解釋放苷元提高了抑制腫瘤細胞的藥效。肺癌是目前危害世界人民的最大惡性腫瘤之一[6-7]，而且還尚未找到有效的治療藥物[8]。我們的研究結果表明龍葵提取物澳洲茄堿的水解苷元澳洲茄胺能更有效地抑制肺癌細胞的生長，從而為緩解和治療腫瘤病患又提供了新的潛在的藥物選擇。

參考文獻

[1]曹熙敏，范翠麗.野生龍葵的開發利用研究進展[J].廣東農業科學，2011(3):40-42.

[2]陳來，李姍姍，金德忠，等.中藥龍葵提取物澳洲茄堿對肺癌細胞抑制作用[J].時珍國醫國藥，2015，26(2):333-334.

[3]羅習珍，陳來，劉建軍，等.高效液相色譜法測定龍葵中的澳洲茄胺[J].時珍國醫國藥，2009,20(2):273-274.

[4]陳來，李姍姍，羅小泉，等.p53抑癌功能的研究進展[J].江西中醫藥大學學報，2014，26(4):93-96.

[5]陳來，胡珺，李姍姍，等.澳洲茄堿對黑色素瘤細胞的抑制作用[J].江西中醫藥，2014，45(12):29-30.

[6]錢桂生，余時滄.肺癌流行病學最新資料與啟示[J].中華結核和呼吸雜志，2012,35(2):86-89.

[7]昌盛，代敏，任建松，等.中國2008年肺癌發病、死亡和患病情況的估計及預測[J].中華流行病學雜志，2012,33(4):391-394.

[8]楊拴盈.肺癌早期診斷的現狀、困惑和希望[J].西安交通大學學報(醫學版)，2011,32(1):1-5.

(收稿日期：2015-11-27)編輯：翟興英

中圖分類號：R285

文獻標識碼：B

*基金項目：江西中醫藥大學博士啟動基金項目(2014BS004)；江西省大學生創新創業教育計劃項目(2014)；江西省衛生廳中醫藥科研計劃項目(2013A072)。