胸腺五肽及其衍生肽的殺菌活性研究Δ

謝 婷，陶廷婷，梁寧生（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530021）

胸腺五肽（Thymopentin）是一種免疫調(diào)節(jié)藥，臨床上廣泛用于免疫力低下等疾病的治療。胸腺五肽是由胸腺生成素Ⅵ中的5 個(gè)氨基酸殘基組成的肽鏈片段，位于多肽的第32～36位，擁有和胸腺生成素Ⅵ相同的全部生理功能。其主要作用之一是促進(jìn)及誘導(dǎo)T細(xì)胞分化，提高生物體的免疫功能。當(dāng)不同的淋巴細(xì)胞的量及功能發(fā)生改變時(shí)，機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生免疫功能失調(diào)，使細(xì)菌等病原微生物容易侵入機(jī)體引起疾病[1]。胸腺五肽可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)而發(fā)揮治療作用，而其是否可以不通過(guò)免疫調(diào)節(jié)而直接殺菌，還從未有過(guò)報(bào)道。筆者嘗試對(duì)胸腺五肽的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。依據(jù)前期研究經(jīng)驗(yàn)，胸腺五肽的分子結(jié)構(gòu)具有抗菌肽的一些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[2]，其氨基酸順序?yàn)榫彼幔ˋrginine，R）-賴氨酸（Lysine，K）-天冬氨酸（Aspartic acid，D）-纈氨酸（Valine，V）-酪氨酸（Tyrosine，Y）（簡(jiǎn)稱RKDVY）。筆者改變其氨基酸結(jié)構(gòu)衍生出2 種衍生肽，希望通過(guò)研究RKDVY 及其衍生肽的殺菌活性，了解RKDVY 是否具有直接的殺菌作用，并初步了解殺菌作用與結(jié)構(gòu)間的關(guān)系。

1 材料

1.1 儀器

Anke TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TU-1810S型紫光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 藥品與試劑

人RKDVY（批號(hào)：130408916）、衍生肽1 RKN（天冬酰胺，N）VY（批號(hào)：130408915）、衍生肽2 RKKVY（批號(hào)：130408914），均由上海波泰生物有限公司合成和純化，純度均＞95%，每管4 mg；1%小牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)：A8010）和4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes，批號(hào)：710B043，純度＞99%）由北京索萊寶科技有限公司提供；LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京路橋技術(shù)責(zé)任有限公司，批號(hào)：120919）；LB培養(yǎng)基粉[生物工程（上海）有限公司，批號(hào)：13052119G]；無(wú)水CaCl2（成都科隆化工試劑廠，批號(hào)：20081106，純度≥96%）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)：NZD1128）。

1.3 細(xì)菌

革蘭陰性（G－）菌：變形桿菌（ATCC 49027）和大腸埃希菌（ATCC 44113）；革蘭陽(yáng)性（G+）菌：糞腸球菌（ATCC 32088）和金黃色葡萄球菌（ATCC 26003）。以上標(biāo)準(zhǔn)株均由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 溶液的制備

以氨基酸序列為模板，設(shè)計(jì)合成了RKDVY、衍生肽1 RKNVY 和衍生肽2 RKKVY，將其溶解于400 μl 滅菌蒸餾水中，制備成質(zhì)量濃度為10 g/L 的溶液，分裝，－20 Ⅵ冷凍保存。每次根據(jù)試驗(yàn)需要取出使用，盡量避免反復(fù)凍融。3種五肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)和特性見表1。

表1 3種五肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)和特性Tab 1 The primary structure and characteristics of three pentapeptides

由表1 可知，3 種五肽都是陽(yáng)離子肽，RKDVY 帶有1 個(gè)正電荷，RKNVY帶有2個(gè)正電荷，RKKVY帶有3個(gè)正電荷；RKKVY堿性最強(qiáng)。三者間的不同都發(fā)生在第3位的氨基酸上。

2.2 殺菌活性的測(cè)定

采用瓊脂鋪板計(jì)數(shù)法[3]。取過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌，按1∶50 比例加入3 ml新鮮LB培養(yǎng)液，于37 Ⅵ恒溫孵育2.5 h（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）；離心收集細(xì)菌，并將其沉淀物溶解于0.5 ml滅菌生理鹽水中，繼以分光光度計(jì)于660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記錄吸光度達(dá)到0.1 時(shí)所需的細(xì)菌濃度，計(jì)算細(xì)菌稀釋倍數(shù)。制備RPMI 1640 反應(yīng)體系，含10 mmol/L Hepes、1 mmol/L CaCl2和1%BSA，pH 為7.4。依次將10μl 細(xì)菌（終濃度為1×107CFU/L）和10 μl 五肽或生理鹽水（對(duì)照）加入到80 μl 的反應(yīng)體系中，混勻，置于恒溫水浴；2 h 后從該體系中取出反應(yīng)液40 μl，加入360μl 滅菌生理鹽水，連續(xù)10 倍稀釋（1 000、250、62.5、15.625μg/ml），共3 次，從每一稀釋倍數(shù)的稀釋液中取出100μl 于無(wú)菌培養(yǎng)皿（直徑為55 mm）中，再加入6 ml約55 Ⅵ滅菌LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂，混勻，凝固，于電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；18～24 h后，計(jì)算細(xì)菌菌落形成單位（CFU），以對(duì)照的CFU在30～300時(shí)為可用數(shù)據(jù)。計(jì)算五肽作用后的殺菌率，繪制殺菌曲線，并與對(duì)照比較。試驗(yàn)重復(fù)5 次，計(jì)算平均值。殺菌率＝（對(duì)照CFU－五肽CFU）/對(duì)照CFU×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)方法。計(jì)量資料以表示，以α＝0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)G－菌的殺菌活性

3種五肽對(duì)G－菌的殺菌活性見表2。

表2 3種五肽對(duì)G－菌的殺菌活性（，n＝5，%）Tab 2 Bactericidal activity of three pentapeptides to G－bacterial（，n＝5，%）

表2 3種五肽對(duì)G－菌的殺菌活性（，n＝5，%）Tab 2 Bactericidal activity of three pentapeptides to G－bacterial（，n＝5，%）

注：與RKDVY比較，＊P＜0.01；與RKNVY比較，#P＜0.01Note：vs.RKDVY，＊P＜0.01；vs.RKNVY，#P＜0.01

由表2 可知，當(dāng)五肽質(zhì)量濃度為1 000μg/ml 時(shí)，RKDVY對(duì)變形桿菌和大腸埃希菌的殺菌活性在50%～60%，而RKNVY 和RKKVY 的殺菌活性在80%左右，均大于RKDVY。與RKDVY 比較，62.5、250、1 000 μg/ml 的RKNVY 和250、1 000 μg/ml 的RKKVY 的殺菌活性增加；與RKNVY 比較，62.5μg/ml的RKKVY的殺菌活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。3種五肽對(duì)G－菌變形桿菌和大腸埃希菌的殺菌活性的強(qiáng)度依次為RKKVY≈RKNVY＞RKDVY。

3.2 對(duì)G+菌的殺菌活性

3種五肽對(duì)G+菌的殺菌活性見表3。

表3 3種五肽對(duì)G+菌的殺菌活性（，n＝5，%）Tab 3 Bactericidal activity of three pentapeptides to G+bacteria（l，n＝5，%）

表3 3種五肽對(duì)G+菌的殺菌活性（，n＝5，%）Tab 3 Bactericidal activity of three pentapeptides to G+bacteria（l，n＝5，%）

注：與RKDVY比較，＊P＜0.01；與RKNVY比較，#P＜0.01Note：vs.RKDVY，＊P＜0.01；vs.RKNVY，#P＜0.01

由表3 可知，當(dāng)五肽質(zhì)量濃度為1 000μg/ml 時(shí)，RKDVY對(duì)金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的殺菌活性在40%左右，而RKNVY的殺菌活性在70%左右，RKKVY的殺菌活性在90%左右。與RKDVY 比較，62.5、250、1 000 μg/ml 的RKNVY 和RKKVY 的殺菌活性增加；與RKNVY 比較，250、1 000 μg/ml的RKKVY的殺菌活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。3種五肽對(duì)G+菌金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的殺菌活性的強(qiáng)度依次為RKKVY＞RKNVY＞RKDVY。

4 討論

4.1 胸腺五肽及其衍生肽的設(shè)計(jì)依據(jù)

目前已知的具有殺菌活性的抗菌肽分子都帶正電荷[3]。筆者先前對(duì)抗菌蛋白——磷脂酶A2衍生肽的研究中也發(fā)現(xiàn)，含有相對(duì)較多的堿性氨基酸、帶正電荷的衍生肽，殺菌強(qiáng)度往往較強(qiáng)[2，4-5]。胸腺五肽也帶有1個(gè)凈正電荷量，是堿性較強(qiáng)的肽分子，很有可能具有殺菌活性。因此，筆者根據(jù)胸腺五肽的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)和合成了分子肽分子RKDVY、RKNVY 和RKKVY，檢測(cè)其殺菌活性，并了解殺菌活性與結(jié)構(gòu)間的關(guān)系。

4.2 胸腺五肽的殺菌作用

以往認(rèn)為，胸腺五肽是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮作用，是免疫調(diào)節(jié)藥。本研究結(jié)果表明，胸腺五肽對(duì)于幾種臨床常見的G－和G+菌具有殺滅作用，具有量效關(guān)系，以往未有相關(guān)報(bào)道。胸腺五肽同時(shí)兼具免疫調(diào)節(jié)活性和殺菌活性兩種重要功能，很可能具有重要的臨床應(yīng)用意義，如第三代頭孢菌素類抗菌藥——頭孢地嗪[6]，兼具廣譜抗菌和免疫調(diào)節(jié)活性雙重作用，特別適合用于免疫能力低又有細(xì)菌感染的患者。

4.3 胸腺五肽及其衍生肽殺菌活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

在結(jié)構(gòu)上，RKNVY 是將胸腺五肽RKDVY 第3位的酸性氨基酸D替換成中性氨基酸N，衍生肽的酸性減弱，堿性增加，所帶的凈正電荷由1變?yōu)?。而衍生肽RKKVY則在同樣位置將酸性氨基酸D 替換成堿性氨基酸K，堿性進(jìn)一步增加，所帶的凈正電荷為3，也是3種肽分子中堿性最強(qiáng)的分子。對(duì)G+菌，堿性最強(qiáng)的RKKVY殺菌活性最強(qiáng)，而堿性居中的RKNVY次之，堿性最弱的RKDVY 最弱。而針對(duì)G－菌時(shí)，增加了堿性RKNVY和RKKVY都比RKDVY強(qiáng)，但在RKNVY和RKKVY間沒(méi)有明顯的差別，提示適當(dāng)增加肽分子的堿性能增強(qiáng)殺菌活性，但進(jìn)一步增加則活性沒(méi)有明顯的增強(qiáng)。這可能與G－菌和G+菌之間結(jié)構(gòu)的差異，特別是細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)。

胸腺五肽作為免疫調(diào)節(jié)劑在臨床已使用多年，其可以通過(guò)提高免疫力用于細(xì)菌感染性疾病[7]。本研究結(jié)果表明，其還具有直接殺菌作用。是否可以將胸腺五肽開發(fā)成為具有免疫調(diào)節(jié)作用和抗菌作用雙重功能的藥物，就像頭孢地嗪一樣，值得進(jìn)一步研究。

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[2]何睿林，梁寧生.人ⅡA型磷脂酶A2衍生肽P26抗菌作用與結(jié)構(gòu)修飾的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（9）：1 300.

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