白芍醇提物及不同極性部位的體外抗氧化作用研究Δ

秦亞東，汪榮斌，周娟娟，楊 茜（.安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，安徽 蕪湖 24002；2.安徽中藥資源研究所，安徽蕪湖 247；.安徽蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心，安徽蕪湖 24000）

白芍（Paeonia radix alba）為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽之功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，白芍在免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)均具有調(diào)節(jié)作用，并具鎮(zhèn)靜、解熱、抗疲勞、抗腫瘤、抗氧化等功效[2-3]。

自由基在體內(nèi)大量堆積后通過發(fā)生過氧化反應(yīng)進(jìn)而引發(fā)多種嚴(yán)重疾病[4]。隨著對(duì)中藥多糖抗氧化作用的研究，發(fā)現(xiàn)許多中藥多糖具有清除自由基的作用。中藥多糖來源廣泛、毒性較低、安全性好，其抗氧化作用的發(fā)現(xiàn)，為體內(nèi)發(fā)生過氧化反應(yīng)而致的機(jī)體損傷等相關(guān)疾病的治療提供了新的途徑和方法。秦亞東等[5-6]對(duì)白芍多糖提取方式及含量進(jìn)行了報(bào)道；徐曉燕等[7]比較了白芍各部位的還原能力及抗植物油脂氧化方面的作用；夏穎等[8]使用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）清除法、Fe3+-三吡啶三吖嗪（FAAP）法考察了白芍粗提物的抗氧化活性。但白芍醇提物（CREt）及不同極性部位的體外抗氧化作用的系統(tǒng)研究尚未見報(bào)道，故筆者選用DPPH·、超氧陰離子自由基（O2－·）、羥基自由基（·OH）這3種常見的體外抗氧化活性試驗(yàn)?zāi)Ｐ停Y選白芍體外抗氧化活性有效部位，以期為白芍在抗氧化劑研發(fā)方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

MS104S 型萬分之一電子天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司]；Cary60 型紫外-可見分光光度計(jì)（美國Agilent公司）；FD8-10型冷凍干燥機(jī)（美國Gold-Sim公司）；3-18K型離心機(jī)（德國Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

DPPH·（美國Sigma 公司，批號(hào)：1898-66-4，純度：≥97.0%）；抗壞血酸（VC，上海國藥集團(tuán)，批號(hào)：20120902，純度：≥99.7%）；水楊酸、鄰苯三酚（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號(hào)：20130905、20131107，純度：≥99.5%、≥99.0%）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl，上海研生生化試劑有限公司，批號(hào)：1183-55-1，純度：≥99.5%）；30%過氧化氫（南京奧佳化工有限公司）；水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

白芍購自安徽亳州中藥材市場(chǎng)（批號(hào)：201306），由安徽中藥資源研究所劉曉龍研究員鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根。

2 方法

2.1 CREt及各部位浸膏的制備

取白芍干燥根500 g，粉碎后過80目篩，以15倍量95%乙醇浸泡1 d，收集濾液，重復(fù)2次，合并濾液后減壓濃縮，低溫真空干燥即得CREt浸膏，得率為6.20%[得率（%）＝提取物干浸膏質(zhì)量（g）/藥材質(zhì)量（g）×100%，下同]。另分別取白芍干燥根500 g，粉碎成粗粉后經(jīng)50%乙醇回流提取2 次，合并濾液，分別以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液經(jīng)旋蒸后低溫干燥，即得石油醚部位（CRP部位）浸膏，得率為0.73%；乙酸乙酯部位（CRE部位）浸膏，得率為1.27%；正丁醇部位（CRB部位）浸膏，得率為1.85%；水部位（CRW部位）浸膏，得率為2.86%。

2.2 DPPH·及VC溶液的制備

精密稱取DPPH·5 mg、VC 10 mg 分別溶于10 ml 95%乙醇中，超聲處理5 min，充分振搖，分別制備成質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml 的DPPH·貯備液和1.00 mg/ml 的VC 貯備液，根據(jù)試驗(yàn)情況再用95%乙醇將貯備液進(jìn)行梯度稀釋。

2.3 DPPH·清除能力的測(cè)定[9-10]

精密稱量“2.1”項(xiàng)下制備的各部位浸膏12 mg，以95%乙醇為溶劑，分別制備成質(zhì)量濃度為0.75、1.5、3、6、12 mg/ml 的樣品溶液。分別取0.2 ml 樣品溶液和2.8 ml 0.05 mg/ml 的DPPH·溶液于10 ml具塞試管中，搖勻，在避光條件下反應(yīng)60 min 后，于517 nm 波長處測(cè)定吸光度（As）；同時(shí)測(cè)定2.8 ml DPPH·溶液與0.2 ml 蒸餾水混合液的吸光度（A0），2.8 ml DPPH·溶液與0.2 ml 95%乙醇混合液的吸光度（A1）。清除率（%）＝[1－（As－A1）/A0]×100%，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。同時(shí)以VC（0.2 mg/ml）為陽性對(duì)照，每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

2.4 O2－·清除能力的測(cè)定[10]

精密稱量“2.1”項(xiàng)下制備的各浸膏6 mg，以95%乙醇為溶劑，分別制備成質(zhì)量濃度為0.5、1、2、4、6 mg/ml 的樣品溶液。取上述樣品溶液1 ml，分別加入5 ml Tris-HCl 緩沖液（pH 7.8），搖勻，置于25 ℃水浴中反應(yīng)20 min 后加入0.2 ml 1.25 mg/ml 的鄰苯三酚溶液，反應(yīng)5 min，加入1 ml 0.3 mg/ml HCl終止反應(yīng)，分別于325 nm 波長處測(cè)定吸光度（As）；以蒸餾水（未加樣品溶液）為空白對(duì)照，測(cè)定溶液吸光度（A0）。清除率（%）＝（A0－As）/A0×100%，并計(jì)算IC50。同時(shí)以VC（0.2 mg/ml）為陽性對(duì)照，每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

2.5 ·OH清除能力的測(cè)定[10]

精密稱量“2.1”項(xiàng)下制備的各浸膏6 mg，以95%乙醇為溶劑，制備成質(zhì)量濃度分別為1.25、2.5、5、10、15 mg/ml 的樣品溶液。取各部位浸膏上述樣品溶液1 ml，分別加入1 ml 0.8 mg/ml 的硫酸亞鐵銨溶液、1 ml 1 mg/ml 的水楊酸溶液、2 ml 0.5%的過氧化氫溶液，并以95%乙醇補(bǔ)足體積至10 ml，置37 ℃水浴中反應(yīng)20 min 后，于510 nm 波長處測(cè)定溶液吸光度。未加樣品溶液的反應(yīng)體系吸光度為A0；因供試液具有顏色，故應(yīng)扣除未加供試液的背景吸光度A；各樣品溶液在反應(yīng)體系中測(cè)定的吸光度為As。清除率（%）＝[A0－（As－A）]/A0×100%，并計(jì)算IC50。同時(shí)以VC（0.2 mg/ml）為陽性對(duì)照，每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 CREt及不同極性部位對(duì)DPPH·的清除作用

在相同質(zhì)量濃度下，CREt和CRE部位清除DPPH·的作用較強(qiáng)，12 mg/ml 時(shí)最大清除率分別可達(dá)（97.55±0.25）%、（82.54±0.36）%；CRP、CRB、CRW 部位對(duì)DPPH·的清除率相對(duì)較低，均未超過40%；各部位最大清除率均不及VC（0.2 mg/ml）組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。CRP、CRB、CRW部位對(duì)3種自由基的清除作用不及CREt和CRE部位，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CREt 和CRE 部位對(duì)DPPH·的清除作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，IC50分別為1.629、2.481 mg/ml，結(jié)果見表1。

3.2 CREt及不同極性部位對(duì)O2－·的清除作用

相同質(zhì)量濃度下，CREt和CRE部位對(duì)O2－·的清除作用較強(qiáng)，6 mg/ml 時(shí)最大清除率可達(dá)81.45%、77.74%；CRP 部位、CRB部位及CRW部位對(duì)DPPH·的清除率相對(duì)較低，均未超過45%；各部位最大清除率均不及VC（0.2 mg/ml）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；CRP部位、CRB部位、CRW部位清除作用不及CREt 和CRE 部位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CREt和CRE部位對(duì)O2－·的清除作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，IC50分別為1.789、1.918 mg/ml，結(jié)果見表2。

表1 CREt 及不同極性部位對(duì)DPPH·的清除試驗(yàn)結(jié)果（，n＝3，%）Tab 1 The elimination results of CREt and different polar parts to DPPH·（，n＝3，%）

表1 CREt 及不同極性部位對(duì)DPPH·的清除試驗(yàn)結(jié)果（，n＝3，%）Tab 1 The elimination results of CREt and different polar parts to DPPH·（，n＝3，%）

注：與VC 比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與CREt 比較，#P＜0.01；與CRE部位比較，ΔP＜0.01Note：vs.VC，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.CREt，#P＜0.01；vs.CRE part，ΔP＜0.01

表2 CREt 及不同極性部位對(duì)O2－·的清除試驗(yàn)結(jié)果（，n＝3，%）Tab 2 The elimination results of CREt and different polar parts to O2－·（，n＝3，%）

表2 CREt 及不同極性部位對(duì)O2－·的清除試驗(yàn)結(jié)果（，n＝3，%）Tab 2 The elimination results of CREt and different polar parts to O2－·（，n＝3，%）

注：與VC比較，＊P＜0.01；與CREt比較，#P＜0.01；與CRE部位比較，ΔP＜0.01Note：vs.VC，＊P＜0.01；vs.CREt，#P＜0.01；vs.CRE part，ΔP＜0.01

3.3 CREt及不同極性部位對(duì)·OH的清除作用

在相同質(zhì)量濃度下，CREt、CRE 部位、CRB 部位清除·OH的作用較強(qiáng)，最大清除率可達(dá)75.28%、72.16%、62.53%；CRP部位、CRW部位對(duì)·OH的清除率相對(duì)較低，均未超過30%；各組最大清除作用均不及VC（0.2 mg/ml）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CRP 部位、CRB 部位及CRW 部位清除作用不及CREt、CRE部位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CREt和CRE部位對(duì)·OH 的清除作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，CREt、CRE 及CRB部位IC50分別為5.268、6.005、7.232 mg/ml，結(jié)果見表3。

表3 CREt 及不同極性部位對(duì)·OH 的清除試驗(yàn)結(jié)果（，n＝3，%）Tab 3 The elimination results of CREt and different polar parts to·OH（，n＝3，%）

表3 CREt 及不同極性部位對(duì)·OH 的清除試驗(yàn)結(jié)果（，n＝3，%）Tab 3 The elimination results of CREt and different polar parts to·OH（，n＝3，%）

注：與VC比較，＊P＜0.01；與CREt比較，#P＜0.01；與CRE部位比較，ΔP＜0.01Note：vs.VC，＊P＜0.01；vs.CREt，#P＜0.01；vs.CRE part，ΔP＜0.01

3.4 陽性對(duì)照VC對(duì)3種自由基的清除作用

按照“2.3”“2.4”“2.5”項(xiàng)下方法分別測(cè)定不同質(zhì)量濃度VC對(duì)DPPH·、·OH、O2－·的清除作用。結(jié)果顯示，VC質(zhì)量濃度在0.02～0.2 mg/ml之間時(shí)，對(duì)3種自由基的清除作用隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。其中當(dāng)VC 質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率達(dá)92.31%；當(dāng)VC質(zhì)量濃度為0.08 mg/ml 時(shí)，對(duì)·OH、O2－·的清除率分別達(dá)到81.68%、82.05%。

4 討論

為了提高試驗(yàn)結(jié)果的可比性，試驗(yàn)中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：第一，試驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格保持試驗(yàn)條件的一致性，包括試劑的配制應(yīng)一次完成，測(cè)試不能分批進(jìn)行等；第二，應(yīng)排除樣品溶液本身顏色帶來的影響；第三，由于各組樣品溶解性不同，在制備高濃度樣品溶液時(shí)可采取超聲、靜置、濾過等方法促進(jìn)各部位浸膏溶解。

試驗(yàn)表明，CREt、CRE 部位對(duì)3 種自由基清除率較強(qiáng)，最大清除率均超過70%，其余部位較弱。CREt 組質(zhì)量濃度為6 mg/ml 時(shí)，與0.1 mg/ml VC 對(duì)DPPH·的清除作用大致相當(dāng)；CREt、CRE 部位質(zhì)量濃度為6 mg/ml 時(shí)，與0.08 mg/ml VC 對(duì)O2－·清除作用大致相當(dāng)；CREt、CRE部位、CRB部位對(duì)·OH最大清除率均未達(dá)到0.08 mg/ml VC 對(duì)·OH 的清除率（81.68%）。各試驗(yàn)組的抗氧化作用均較VC弱，但各組間對(duì)3種自由基的清除作用又存在差異，且大致呈現(xiàn)濃度依賴。關(guān)于抗氧化作用不強(qiáng)的原因，可能是由于各試驗(yàn)組中的抗氧化成分純度不高造成的。夏穎等[8]采用現(xiàn)代分離提取方法從白芍中提取出了單一化學(xué)成分五沒食子酰基葡萄糖（PCG），對(duì)DPPH·的清除作用就大于VC。PCG 為小分子化合物（CREt中的一個(gè)化合物），極性較大，可溶于極性較大的乙醇中，而CREt 在本研究中抗氧化活性也較高，因此夏穎等的結(jié)論一定程度上在本試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。盡管文中選取的3種經(jīng)典體外抗氧化模型具有很大的代表性[10-12]，但仍不能代表白芍抗氧化的全部活性，且體外模型抗氧化作用不能真正代表體內(nèi)抗氧化作用，體內(nèi)、體外抗氧化作用之間的相關(guān)性也有待進(jìn)一步研究。

使用不同極性溶劑提取中藥，獲得各部位提取物，然后通過所選指標(biāo)進(jìn)行藥效活性部位的篩選和排除，是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究常用手段之一[11]。本研究初步排除了CRP、CRW部位，確定了CREt、CRE部位為抗氧化活性有效部位，在此基礎(chǔ)上筆者將進(jìn)一步對(duì)活性部位進(jìn)行研究。

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