藏藥佐太對(duì)大鼠CYP1A2和NAT2活性的影響Δ

范雪汝，朱俊博，姚星辰，袁 明，李向陽(yáng)（青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，西寧 810001）

佐太又名佐塔，是將劇毒水銀特殊炮制后加其他輔助藥物，經(jīng)過(guò)一系列炮制工藝制成的黑色粉末，具有調(diào)血、生肌健脾、滋補(bǔ)強(qiáng)身的功效，被雪域人民稱之為藏藥中的至寶[1]。曾勇等[2]研究發(fā)現(xiàn)，其具有一定的鎮(zhèn)靜和催眠作用。目前對(duì)佐太的研究主要集中在毒性方面[3-5]，而對(duì)佐太與藥物代謝關(guān)系方面的研究報(bào)道較少。

細(xì)胞色素氧化酶（CYP1A2）是最重要的肝藥酶之一，而藥物代謝酶N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶2（NAT2）參與了20多種肼類化合物及致癌性芳香胺和雜環(huán)胺類化合物的生物激活或滅活代謝。因此，研究藥物對(duì)以上兩種酶活性的影響，對(duì)于闡明藥物的相互作用具有重要意義。目前，在CYP1A2與NAT2酶活性的測(cè)定中，最常用的方法是通過(guò)測(cè)定探針?biāo)幬飦?lái)反映酶活性的變化。咖啡因以其安全性好的特點(diǎn)，已成為一種有效的探針?biāo)幬颷6]，其代謝產(chǎn)物主要為5-乙酰氨基-6-甲酰氨基-3-甲基尿酸（AFMU）、1-甲基黃嘌呤（1X）、1-甲基尿酸（1U）、1，7-二甲基尿酸（17U）。常用AFMU/（AFMU+1X+1U）比值來(lái)反映NAT2酶的活性（比值越低，酶活性越低）；因17U 僅由CYP1A2 酶催化，所以常用（AFMU+1X+1U）/17U 比值來(lái)反映CYP1A2 酶的活性（比值越低，酶活性越低）[7-8]。筆者通過(guò)探討藏藥佐太對(duì)藥物代謝酶CYP1A2和NAT2活性的影響，期望為藏藥方劑的合理配伍和臨床合理用藥提供一定的參考。

1 材料

1.1 儀器

1200 型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Agilent 公司）；N2000色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息工程研究所）；XW-80A漩渦混合器（上海精科有限公司）；TGL-16B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Optima MAX-XP 超速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter有限公司）。

1.2 藥品與試劑

佐太（青海省藏醫(yī)院，批號(hào)：20111002，主要含汞、金、銅和鉛等金屬，含量分別為52.29%、0.14%、0.26%、0.17%）；咖啡因（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20071224，純度：≥99%）；AFMU（加拿大Toronto 化學(xué)試劑公司，批號(hào)：1-JHW-86-1，純度：≥94%）；1U（德國(guó)Fluka 公司，批號(hào)：1399520，純度：≥98%）；1X（加拿大Toronto化學(xué)試劑公司，批號(hào)：2-FJ-103-1，純度：≥97%）；17U（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：87H2516，純度：≥95%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

2 方法與結(jié)果

2.1 分組與給藥

將70 只大鼠隨機(jī)均分為正常對(duì)照（生理鹽水）組和佐太低、中、高劑量（1.2、3.8、12 mg/kg）的單次給藥組和多次給藥組（每天1 次，連續(xù)12 d）。正常對(duì)照組、單次給藥組大鼠于第2天，多次給藥組大鼠于第13 天均按25 mg/kg 劑量ig 探針?biāo)幬锟Х纫颉＝o藥劑量依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。

2.2 樣品采集

各組大鼠ig咖啡因5 h后采集尿液，按10 mg/ml的量加入維生素C，冷凍保存，備用。

2.3 含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%醋酸（B），采用梯度洗脫（0～7 min，2%～8%A；7～15 min，8%A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.3.2 樣品預(yù)處理 取“2.2”項(xiàng)下尿樣0.2 ml 于離心管中，4 ℃、16 000 r/min離心10 min（離心半徑為6 cm），收集上清液。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取1X 5.00 mg，置于5 ml量瓶中，加人純凈水溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/ml 的1X貯備液。取1X貯備液0.5 ml于5 ml量瓶中，加入純凈水定容至刻度，取適量上述溶液，稀釋成質(zhì)量濃度分別為10、1 μg/ml 的1X 對(duì)照品溶液。同法制備質(zhì)量濃度分別為10、1 μg/ml的1U、17U和AFMU對(duì)照品溶液。

2.3.4 專屬性考察 分別取一定質(zhì)量濃度的1X、1U、17U、AFMU對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理的空白尿液，1X、1U、17U、AFMU對(duì)照品溶液和空白尿液的混合液，給藥5 h后的尿液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，尿液中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾1X、1U、17U 和AFMU 的測(cè)定，且各物質(zhì)間分離度較好，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取數(shù)支離心管，分別加入1X、1U、17U 和AFMU 對(duì)照品溶液適量，用空白尿液稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、2、4、6、10、20 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)尿液樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度制備5份。按“2.3.2”項(xiàng)下離心操作，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，1X、1U、17U、AFMU檢測(cè)在質(zhì)量濃度1～20 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，回歸方程見(jiàn)表1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品溶液；B.空白尿液；C.空白尿液+對(duì)照品溶液；D.給藥5 h后尿液；1.AFMU；2.1U；3.1X；4.17UFig 1 HPLC chromatographA.reference solution；B.blank urine；C.blank urine added with reference solution；D.urine after administration 5 h；1.AFMU；2.1U；3.1X；4.17U

表1 回歸方程結(jié)果Tab 1 Results of regression equation

2.3.6 方法回收率與精密度試驗(yàn) 按“2.3.5”項(xiàng)下方法分別制備質(zhì)量濃度為1、6、20 μg/ml 的1X、1U、17U、AFMU 標(biāo)準(zhǔn)尿液樣品。按“2.3.2”項(xiàng)下離心操作后按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣（每個(gè)質(zhì)量濃度連續(xù)進(jìn)樣5 次），記錄色譜圖，計(jì)算方法回收率。同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，考察日內(nèi)精密度；每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5 d，考察日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（，n＝5）Tab 2 Results of relative recovery rates and precision test（，n＝5）

表2 方法回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（，n＝5）Tab 2 Results of relative recovery rates and precision test（，n＝5）

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3.5”項(xiàng)下方法分別制備質(zhì)量濃度為1、6、20 μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)尿液樣品，各8 份。分別在室溫放置0、8 h和－20 ℃冷凍1、10、30、60、90、120 d 后自然解凍。按“2.3.2”項(xiàng)下離心操作，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度尿液樣品的RSD 分別為AFMU：5.12%、4.33%和2.80%（n＝8），1U：7.02%、5.44%和4.60%（n＝8），1X：8.10%、6.79%和6.01%（n＝8）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.5 CYP1A2和NAT2活性測(cè)定及評(píng)價(jià)

給予探針?biāo)幬锟Х纫? h 后，采用HPLC 法分別測(cè)定尿液中咖啡因代謝產(chǎn)物AFMU、1U、1X、17U 的含量，以（AFMU+1X+1U）/17U 比值評(píng)價(jià)CYP1A2活性，以AFMU/（AFMU+1X+1U）比值評(píng)價(jià)NAT2的活性。結(jié)果，與正常對(duì)照組比較，中劑量單次給藥組，中、高劑量多次給藥組大鼠CYP1A2 的活性分別降低了44.7%、28.2%和51.2%，NAT2 的活性分別降低了29.9%、16.4%和16.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CYP1A2和NAT2活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠CYP1A2和NAT2活性測(cè)定結(jié)果（，n＝10）Tab 3 Results of the activities of CYP1A2 and NAT2 in rats of all groups（，n＝10）

表3 各組大鼠CYP1A2和NAT2活性測(cè)定結(jié)果（，n＝10）Tab 3 Results of the activities of CYP1A2 and NAT2 in rats of all groups（，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，汞、砷、銀、鋅、鉛等金屬對(duì)CYP450酶活性有抑制作用[9-10]。而佐太主要含汞、金、銀、鐵等金屬，本研究結(jié)果顯示，中劑量和高劑量佐太對(duì)CYP1A2和NAT2的活性均有抑制作用，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致。

AFMU 作為咖啡因代謝物之一，其性質(zhì)極不穩(wěn)定，因此，本研究將尿液用維生素C進(jìn)行了酸化，并且及時(shí)進(jìn)行操作，盡量縮短處理時(shí)間。欲考察酶活性，必須選擇針對(duì)特異性的底物進(jìn)行分析。應(yīng)用咖啡因進(jìn)行NAT2的活性分析是20世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的方法，與其他探針?biāo)幬锉龋Х纫驔](méi)有不良反應(yīng)，受試者易于接受。本研究采用梯度洗脫的方法測(cè)定主要代謝物的含量，較之傳統(tǒng)的尿液直接進(jìn)樣，不僅有助于保護(hù)分析柱，而且也提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

本研究結(jié)果中，中劑量單次給藥組大鼠CYP1A2和NAT2的活性均顯著降低，但高劑量單次給藥組大鼠CYP1A2的活性反而升高，推測(cè)金屬對(duì)酶的活性影響可能與金屬離子的濃度有關(guān)，超過(guò)一定范圍后對(duì)酶活性就沒(méi)有影響。而高劑量多次給藥組大鼠CYP1A2的活性又顯著降低，推測(cè)多次給藥引起了大鼠肝、腎功能損傷，所以影響了酶的活性，具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另外，本研究采用青海省藏醫(yī)院研制的佐太作為研究對(duì)象，而西藏、四川、甘肅等地的佐太是否也會(huì)有相同結(jié)果，以及在人體中能否得到相同的結(jié)果，也有待進(jìn)一步考察。

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