復(fù)方香芪顆粒對(duì)白癜風(fēng)模型豚鼠的藥效學(xué)研究Δ

周瑞瑞，毛士龍（上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 200031）

白癜風(fēng)是一種后天性色素減退性皮膚病，表現(xiàn)為局部性或泛發(fā)性色素脫失。該病發(fā)病率高、病程長(zhǎng)且治愈率低。由于該病的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚[1]，且目前尚無(wú)滿意的治療方法，因此臨床迫切需要療效確切、不良反應(yīng)小的新藥出現(xiàn)。

復(fù)方香芪顆粒原處方名為祛白方，是我院結(jié)合傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在對(duì)白癜風(fēng)認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立的協(xié)定方，具有充分的理論依據(jù)，同時(shí)已在我院臨床應(yīng)用20 多年，療效確切，故還具有充分的臨床實(shí)踐依據(jù)[2-3]。本研究擬探討復(fù)方香芪顆粒對(duì)白癜風(fēng)模型豚鼠的藥效學(xué)作用，以為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

XD811 半自動(dòng)生化分析儀（上海迅達(dá)醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

丹參、降香、白薇、紫草、蒼術(shù)、紅花、龍膽草、女貞子、白蒺藜、海螵蛸、甘草、龜板購(gòu)于上海萬(wàn)仕誠(chéng)國(guó)藥制品有限公司，批號(hào)：20120506，符合2010版《中國(guó)藥典》的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

復(fù)方香芪顆粒（自制，規(guī)格：0.45 g/粒）、白癜風(fēng)膠囊（天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20110302，規(guī)格：0.45 g/粒），臨用前均用蒸餾水制備成相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶液；丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20120403）、膽堿酯酶（ChE）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20120305）均由南京建成生物工程研究所提供；過(guò)氧化氫溶液（上海桃浦化工廠，批號(hào)：20120402）。

1.3 動(dòng)物

2 方法

2.1 復(fù)方香芪顆粒處方及提取、制粒方法

2.1.1 處方 丹參10 g、降香3 g、白薇10 g、紫草10 g、蒼術(shù)10 g、紅花6 g、龍膽草10 g、女貞子12 g、白蒺藜10 g、海螵蛸10 g、甘草6 g、龜板5 g。

2.1.2 提取、制粒 各中藥按處方比例用水提取，濃縮，用70%乙醇沉淀，上清液濃縮成浸膏，出膏率為23%。取提取物100 g，加入包合劑（環(huán)糊精）10 g、矯味劑（甜菊糖苷）3 g、成型劑（聚乳糖）5 g，攪拌，濾過(guò)，噴霧干燥，加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）2 g，干式制粒，整粒，即得產(chǎn)品。噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度為170 ℃、出風(fēng)溫度為80 ℃，制得的粉粒含水分5%，直接干式制粒，制粒時(shí)物料溫度在60 ℃以下。

2.2 分組及模型制備[4]

2.3 給藥[5]

空白對(duì)照組和模型對(duì)照組從建模第11 天起用蒸餾水灌胃，每只2 ml，每天1次。白癜風(fēng)膠囊組按人用推薦劑量（按照人體質(zhì)量60 kg 計(jì)）換算成豚鼠的給藥劑量即50 mg/（kg·d）。復(fù)方香芪顆粒低、中、高劑量組分別為25、100、400 mg/（kg·d），其中劑量按人用推薦劑量而得。各藥物組溶于蒸餾水中給藥，體積均為2 ml。從建模第11天起灌胃給藥，每天1次，連續(xù)40 d。

2.4 病理學(xué)觀察

給藥結(jié)束后，取用藥部位中心1 cm×1 cm皮膚，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，用多巴氧化酶法[6]進(jìn)行黑色素染色，隨意觀察50 個(gè)毛囊，計(jì)算其中黑色素毛囊數(shù)及皮膚黑色素的分布情況。表皮黑色素分布的等級(jí)：“+++”示表皮基底細(xì)胞及棘層均有黑色素；“++”示表皮基底細(xì)胞及棘層1/2 以上有黑色素；“+”示表皮基底細(xì)胞及棘層1/2～1/3 有黑色素；“±”示表皮基底細(xì)胞及棘層偶見(jiàn)黑色素；“-”示表皮基底細(xì)胞及棘層未見(jiàn)黑色素[7]。

2.5 ChE活性、MDA含量及血液流變學(xué)指標(biāo)測(cè)定

末次給藥2 h后，各組豚鼠用3.5%水合氯醛（10 ml/kg）麻醉后腹主動(dòng)脈取血，加入肝素抗凝管中離心得血漿，按照試劑盒操作測(cè)定血漿中ChE 活性、MDA 含量；另取血于生化分析儀中測(cè)定血液流變學(xué)指標(biāo)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組豚鼠皮膚黑色素分布及黑色素毛囊數(shù)觀察結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組豚鼠皮膚黑色素分布較少，黑色素毛囊數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），符合造模要求。與模型組比較，白癜風(fēng)膠囊組及復(fù)方香芪顆粒低、中、高劑量組豚鼠黑色素的分布以及黑色素毛囊數(shù)均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），詳見(jiàn)表1。

表1 各組豚鼠黑色素分布及黑色素毛囊數(shù)觀察結(jié)果Tab 1 Distribution of melanin distribution of skin melanin and the number of black hair follicle in guinea pigs of each group

3.2 各組豚鼠血漿ChE、MDA檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組豚鼠血漿ChE 活性顯著降低，MDA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），符合該模型的要求。與模型對(duì)照組比較，白癜風(fēng)膠囊組及復(fù)方香芪顆粒低、中、高劑量組豚鼠血漿ChE活性升高、MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見(jiàn)表2。

表2 各組豚鼠血漿ChE、MDA檢測(cè)結(jié)果Tab 2 Determination results of plasma ChE and MDA in guinea pigs of each group

3.3 各組豚鼠血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組豚鼠血漿黏度、全血黏度及血細(xì)胞比容顯著升高，紅細(xì)胞沉降率顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），符合白癜風(fēng)臨床特征，表明造模成功。白癜風(fēng)膠囊組及復(fù)方香芪顆粒中、高劑量組豚鼠血液黏度、全血黏度及血細(xì)胞比容顯著降低，紅細(xì)胞沉降率顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），低劑量組豚鼠血漿黏度和全血黏度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表3。

4 討論

白癜風(fēng)主要因先天稟賦不足、驚恐傷腎、郁怒傷肝、日久耗傷陰血、阻滯經(jīng)脈，使局部氣血淤滯、致肌膚不得濡養(yǎng)所致，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，中醫(yī)對(duì)其已積累了豐富的臨床治療經(jīng)驗(yàn)[8-9]。白癜風(fēng)膠囊含有補(bǔ)骨脂、蒺藜、川芎、當(dāng)歸、紅花、香附等成分，在臨床已應(yīng)用多年，為治療白癜風(fēng)經(jīng)典藥物[10-11]，故本研究將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，但研究表明其與遺傳因素、自身免疫、神經(jīng)化學(xué)因子、氧化應(yīng)激、酪氨酸缺乏等有關(guān)[12]。筆者采用5%過(guò)氧化氫化學(xué)脫色法制備白癜風(fēng)的豚鼠模型，模型對(duì)照組肉眼觀察及切片鏡下結(jié)果均符合白癜風(fēng)患者皮膚臨床病理特征；血漿中ChE 活性降低、MDA 含量升高也符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的神經(jīng)化學(xué)因子、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)[13]；全血及血漿黏度升高也符合中醫(yī)氣血淤滯之說(shuō)，表明模型建立成功。

表3 各組豚鼠血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Tab 3 Determination results of hemorheology indexes in guinea pigs of each group

白癜風(fēng)的發(fā)生與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系[14]，表皮內(nèi)活性氧族過(guò)度聚集使黑素細(xì)胞膜脂質(zhì)不穩(wěn)定，黑素細(xì)胞膜脂質(zhì)合成及循環(huán)紊亂導(dǎo)致黑色素細(xì)胞被破壞。MDA 是脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，為氧化應(yīng)激發(fā)生的指標(biāo)。Yildirim M等[15]發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者活體組織中MDA水平較正常人顯著增加，也有學(xué)者提出白癜風(fēng)患者體內(nèi)氧化應(yīng)激的失衡很有可能源于表皮細(xì)胞中心磷脂的組成與功能異常，其能導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈活性下降，繼而誘導(dǎo)活性氧族過(guò)度產(chǎn)生，介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞的死亡。皮膚黑色素的合成涉及一系列的過(guò)程，在神經(jīng)化學(xué)因子學(xué)說(shuō)中，神經(jīng)末梢分泌的化學(xué)物質(zhì)如乙酰膽堿能夠在體外損傷黑色素細(xì)胞、抑制其合成[16]。ChE活力下降的時(shí)候，乙酰膽堿消除減少，在突觸間隙的含量增加，黑色素細(xì)胞的損傷增加[17-18]。

復(fù)方香芪顆粒原方中當(dāng)歸、黃芪柔肝養(yǎng)血，健脾益氣，補(bǔ)后天之本以充氣血生化之源；補(bǔ)骨脂益腎填髓，其含有呋喃香豆素類物質(zhì)，可提高皮膚對(duì)紫外線的敏感性，刺激黑色素細(xì)胞的形成，對(duì)酪氨酸酶的活性也有較強(qiáng)的激活作用；川芎、紅花、丹參行氣活血；白蒺藜、香附疏風(fēng)祛邪以通絡(luò)，共奏調(diào)和氣血、活血化瘀之效。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方香芪顆粒能顯著增加白癜風(fēng)模型豚鼠皮膚黑色素的分布以及黑色素毛囊數(shù)，提高血漿中ChE的活性、降低MDA含量，同時(shí)改善血液循環(huán)，表明其對(duì)白癜風(fēng)模型豚鼠相關(guān)指標(biāo)具有良好的改善作用，并呈較好的量效關(guān)系。因此，本研究結(jié)果為該藥的臨床應(yīng)用提供了較好的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]周暉，韓建德，曹光玲，等.白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2012，19（2）：111.

[2]李梅云，李大寧，張?jiān)＠ぃ?自擬白靈方治療白癜風(fēng)的療效觀察[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48（19）：54.

[3]李大寧，劉進(jìn)芬，李梅云，等.自擬祛白方治療白癜風(fēng)的療效觀察[J].中華實(shí)用醫(yī)藥雜志，2010，10（3）：154.

[4]葉伊琳，唐潔，劉琴，等.復(fù)方補(bǔ)骨脂搽劑對(duì)豚鼠白癜風(fēng)模型作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37（4）：252.

[5]施慧，龍子江，王靚，等.白二丸對(duì)氫醌誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)豚鼠治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2010，17（1）：28.

[6]董妙珠，肖萍，洪新宇，等.不同染色法檢測(cè)豚鼠皮膚黑色素的比較研究[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2006，23（5）：403.

[7]張?zhí)m蘭，閆明，劉曉東，等.兩種化學(xué)脫色劑對(duì)兩種動(dòng)物模擬白癜風(fēng)作用比較[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28（6）：690.

[8]沈麗，黃云英，王雪妮，等.菟絲子外用對(duì)實(shí)驗(yàn)性豚鼠白癜風(fēng)的藥效[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（16）：199.

[9]何文，韓瑞玲，羅順德.8-甲氧補(bǔ)骨脂素脂質(zhì)體凝膠對(duì)白癜風(fēng)模型豚鼠的治療作用研究[J].中國(guó)藥房，2005，16（2）：92.

[10]于玲，賀博峰，宋慶華.白癜風(fēng)膠囊的薄層色譜鑒別[J].中國(guó)藥師，2004，7（4）：264.

[11]江平，陸新顏.白癜風(fēng)膠囊治療白癜風(fēng)的臨床研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，28（7）：1 080.

[12]Abu Tahir M，Pramod K，Ansari SH，et al.Current remedies for vitiligo[J].Autoimmun Rev，2010，9（7）：516.

[13]陳惠英，許愛(ài)娥.白癜風(fēng)表皮微環(huán)境研究進(jìn)展[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2008，22（2）：113.

[14]劉邦民，堅(jiān)哲，李春英，等.抗氧化應(yīng)激中藥在白癜風(fēng)治療中的潛在應(yīng)用[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2012，21（8）：1 363.

[15]Yildirim M，Baysal V，Inaloz HS，et al.The role of oxidants and antioxidants in generalized vitiligo at tissue level[J].J Eur Acard Dermatol Venereol，2004，18（6）：683.

[16]Wu CS，Yu HS，Chang HR，et al.Cutaneous blood flow and adrenoceptor response increase in segmental-type vitiligo lesions[J].J Dermatol Sci，2000，23（1）：53.

[17]Dell’Anna ML，Ottaviani M，Albanesi V，et al.Membrane lipid alterations as a possible basis for melanocyte degeneration in vitiligo[J].J Invest Dermatol，2007，127（5）：1 226.

[18]Lan WJ，Wang HY，Wei L，et al.Evidence that geniposide abrogates norepinephrine-induced hypopigmentation by the activation of GLP-1R-dependent c-kit receptor signaling in melanocyte[J].J Ethnopharmacol，2008，118（1）：154.