扇貝糖胺聚糖對OX-LDL 誘導血管內皮細胞氧化應激損傷的抑制作用機制研究Δ

鞠傳霞，侯 琳，叢培陽，王嘉怡，孫福生，王 蕾，張 芳，劉 賽（.青島大學藥學院，山東 青島 660；.威海衛人民醫院，山東 威海 6400）

目前公認血管內皮細胞的損傷及其功能異常是多種心血管事件發生的始動、關鍵性環節[1]。氧化應激是氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）、腎素-血管緊張素系統、同型半胱氨酸等危險因素導致內皮細胞損傷的共同通路[2]。青島大學醫學院藥理教研室從櫛孔扇貝裙邊中提取出有效成分——扇貝糖胺聚糖（Scallop skirt glycosaminoglycan，SS-GAG），已獲得發明專利（ZL 200410035656.3）。前期研究發現50、100、200 mg/L SSGAG能對抗OX-LDL、多聚陽離子、Fenton體系和過氧化氫誘導的人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）氧化應激損傷[3-6]，保護血管內皮細胞。本研究擬通過OX-LDL 復制HUVEC 損傷模型，從細胞和分子水平進一步研究其作用機制。

1 材料

1.1 儀器

FACS Calibur型流式細胞儀（美國BD公司）；7600型全自動生化分析儀（日本Hitachi 公司）；RG 3000 型實時熒光聚合酶鏈反應（RT-PCR）儀（德國Qiagen公司）；2100 C型自動酶標儀（美國Rayto 公司）；Trans-Blot SD 型半干電轉膜儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

SS-GAG（青島大學醫學院藥理教研室，純度：96%）；RPMI 1640 培養基、胎牛血清（美國Hyclone 公司）；MTT（美國Sigma 公司）；乳酸脫氫酶（LDH）、活性氧（ROS）測試盒（上海碧云天生物科技有限公司）；Trizol（上海Invitrogen公司）；反轉錄試劑盒（美國Promega 公司）；小鼠抗人NOX4 單克隆抗體、小鼠抗人β-actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 細胞

HUVEC購自中國科學院細胞庫。

2 方法

2.1 OX-LDL制備及鑒定

利用CuSO4修飾低密度脂蛋白制備OX-LDL，采用硫代巴比妥酸法鑒定[3]。

2.2 細胞培養與分組

HUVEC 接種于培養瓶內，用含10%胎牛血清、1×105u/L青/鏈霉素雙抗的RPMI 1640 培養基，置于37 ℃、5%CO2條件下培養細胞。試驗分為陰性對照（無血清培養基處理12 h）組、模型（50 mg/L OX-LDL處理24 h）組與SS-GAG高、中、低濃度（分別以質量濃度為200、100、50 mg/L的SS-GAG預處理12 h，后均用50 μmol/L OX-LDL處理24 h）組。

2.3 細胞活力測定[6]

取對數生長期細胞，調整細胞密度至1×108L－1，接種于96孔板中，每個濃度設6個復孔。按“2.2”項下方法處理細胞后，加入10 g/L MTT 10 μl培養4 h，每孔加入150 μl MTT溶解，用酶標儀于490 nm波長處測定光密度（OD）以代表細胞活力。

2.4 LDH活性測定

按“2.2”項下方法處理細胞后，收集上清培養液，取6 μl樣品與200 μl LDH測試盒R1 試劑混勻，37 ℃孵育3 min；再加入100 μl R2 試劑，37 ℃孵育90 s，全自動生化分析儀連續監測2 min吸光度（A）變化，計算ΔA/min。LDH活性（U/L）＝ΔA/min×F，式中F為常數（8 095）。

2.5 ROS水平測定

熒光定量法測定ROS 水平。2′，7′-二氯熒光二乙酸鹽穿過細胞膜后，在胞內水解生成還原型二氯熒光素（DCFH）。細胞內ROS能氧化DCFH生成有熒光的氧化型二氯熒光素。將細胞與1 ml 二氯熒光黃二乙酸酯（DCFH-DA）置于37 ℃培養箱中，避光孵育20 min。按“2.2”項下方法處理細胞后，常規洗細胞2 遍，流式細胞儀檢測ROS 水平（激發光波長488 nm，發射光波長525 nm）。

2.6 氧化低密度脂蛋白受體1（LOX-1）mRNA表達測定

RT-PCR 法測定LOX-1 mRNA 表達。按“2.2”項下方法處理細胞后，Trizol 試劑提取總RNA，反轉錄生成cDNA后，進行SYBR Green 熒光定量PCR。LOX-1 上游引物：5′-GAGAGTAGCAAATTGTTCAGCTCCTT-3′，下 游 引 物：5′-GCCCGAGGAAAATAGGTAACAGT-3′；GAPDH 上游引物：5′-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3′，下游引物：5′-GGCCTCTCTCTTGCTCTCAGTATC-3′。反應條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 次循環。熒光值以ct值表示，LOX-1 mRNA的表達水平以LOX-1與GAPDHct的相對值表示，以2－ΔΔct法統計分析。

2.7 NOX4蛋白表達測定

Western blot測定NOX4蛋白表達。按“2.2”項下方法處理細胞后，收集細胞，加細胞裂解液冰浴20 min，12 000×g離心5 min，超聲裂解，取上清，用Bradford法蛋白定量。十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，轉膜和封閉，與小鼠抗人NOX4 單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗人βactin單克隆抗體（1∶1 000）于4 ℃搖床過夜孵育，然后與辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h。加入顯色底物，顯影后讀片，并進行掃描分析。

2.8 統計學方法

采用SPSS 13.0 軟件處理試驗數據。各組數據均為計量資料，以表示，采用LSD 檢驗進行分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組細胞活力與LDH活性測定結果

與陰性對照組比較，模型組細胞活力降低，LDH 活性增強，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，SS-GAG高、中、低濃度組細胞活力增強，LDH 活性減弱，差異有統計學意義（P＜0.01）。各組細胞活力與LDH活性測定結果見表1。

表1 各組細胞活力與LDH活性測定結果（，n＝3）Tab 1 Determination results of the viability and LDH activity of cells in all groups（，n＝3）

表1 各組細胞活力與LDH活性測定結果（，n＝3）Tab 1 Determination results of the viability and LDH activity of cells in all groups（，n＝3）

注：與陰性對照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01Note：vs.negative control group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

3.2 各組細胞ROS水平測定結果

與陰性對照組比較，模型組細胞內ROS水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，SS-GAG高、中、低濃度組細胞ROS水平降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。各組細胞ROS水平測定結果見圖1、表2。

3.3 各組細胞LOX-1 mRNA表達測定結果

與陰性對照組比較，模型組細胞LOX-1 mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，SS-GAG高、中、低濃度組細胞LOX-1 mRNA 表達減弱，差異有統計學意義（P＜0.01）。各組細胞LOX-1 mRNA表達測定結果見表2。

3.4 各組細胞NOX4蛋白表達測定結果

與陰性對照組比較，模型組細胞NOX4蛋白表達增強，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，SS-GAG高、中、低濃度組細胞NOX4 蛋白表達減弱，差異有統計學意義（P＜0.01）。各組細胞NOX4蛋白表達測定結果見圖2。

圖1 各組細胞ROS水平測定結果（，n＝3）Fig 1 Determination results of the ROS level in cells in all groups（，n＝3）

表2 各組細胞ROS 和LOX-1 mRNA 水平測定結果（，n＝3）Tab 2 Determination results of the levels of ROS and LOX-1 mRNA in cells in all groups（，n＝3）

表2 各組細胞ROS 和LOX-1 mRNA 水平測定結果（，n＝3）Tab 2 Determination results of the levels of ROS and LOX-1 mRNA in cells in all groups（，n＝3）

注：與陰性對照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01Note：vs.negative control group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

4 討論

OX-LDL 誘導的血管內皮細胞的損傷及其功能異常是動脈粥樣硬化發生的始動和關鍵性環節。氧化應激是OX-LDL導致內皮細胞損傷的主要通路[2]。氧化應激破壞細胞膜，增加膜通透性，釋放胞內LDH，LDH釋放量可反映膜的完整性。本研究結果表明，經OX-LDL 處理后，模型組細胞活力減弱，LDH 釋放量增多；而SS-GAG 能促進細胞增殖，抑制LDH 釋放，保護血管內皮細胞。

在正常情況下，體內ROS 的產生和清除處于動態平衡。一旦內源性氧化酶如NADPH氧化酶（NOX）[7]產生過多ROS，超過體內抗氧化體系的清除能力，體內氧自由基代謝就會失衡，發生氧化應激反應[8]。因此，清除ROS 是保護血管內皮細胞免受損傷的關鍵。本研究結果表明，OX-LDL能明顯升高細胞內ROS 水平，不同質量濃度的SS-GAG 均可抑制ROS 的水平升高。

圖2 各組細胞NOX4蛋白表達測定結果（，n＝3）A.電泳圖；B.柱形圖注：與陰性對照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01Fig 2 Determination results of NOX4 protein expression in cells in all groups（，n＝3）A.electrophoresis chart；B.columnNote：vs.negative control group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

LOX-1 是血管內皮細胞攝取和代謝OX-LDL 的主要受體[9]，在動脈硬化發生過程中起重要作用[10-11]。LOX-1 和OX-LDL 結合后通過NADPH 氧化酶途徑，促進ROS 生成[12]。研究表明，NOX4是血管內皮細胞最主要的內源性ROS來源[13]。本研究結果表明，OX-LDL 處理后細胞LOX-1 mRNA 表達增強，NOX4 蛋白表達增強；SS-GAG 可抑制LOX-1 mRNA 和NOX4蛋白表達的增強。

綜上所述，SS-GAG 可經LOX-1/NOX4 途徑抑制ROS 產生，發揮保護OX-LDL 誘導的血管內皮細胞損傷的作用。本研究為海洋活性物質發揮保護血管內皮作用提供了直接的試驗依據，為將SS-GAG研制開發成具有自主知識產權的具有血管保護活性的保健品或藥品提供更多的理論和試驗依據。

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