黑順片與大黃聯用對次烏頭堿在大鼠體內藥動學的影響

干小紅，任常諭（成都市第五人民醫院藥劑科，成都 611130）

附子是毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的子根加工品，味辛、甘，性熱，有毒[1]。因為其生品有大毒，所以臨床上多用其炮制品。黑順片為附子的加工炮制品，其中毒性成分烏頭堿、中烏頭堿的含量很低，主要的毒性成分為次烏頭堿。附子配伍大黃為常用藥對，源于張仲景的《金匱要略》中的“大黃附子湯”，方中以大黃苦寒攻下，附子辛熱散寒，寒熱并用，相反相成，主治寒積便秘。現代化學和藥理學研究表明，附子配伍大黃具有增效減毒的作用，但從藥動學角度研究其配伍機制的報道甚少。為了探索其配伍機制，更好地了解附子配伍大黃中成分發揮藥理作用的過程和機制，相應的藥動學研究顯得非常必要。筆者選取臨床上常用的附子的炮制品黑順片與大黃聯用，采用高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）法，以鹽酸巴馬汀為內標，研究其對次烏頭堿在大鼠體內藥動學的影響。

1 材料

1.1 儀器

WatersZQ2000-LC-MS 分析儀（美國Waters 公司）；1424-1型臺式高速離心機、0412-1型臺式低速離心機（上海醫療器械有限公司手術器械廠）。

1.2 藥材、藥品與試劑

黑順片為毛茛科多年生草本植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的子根的炮制加工品，大黃為唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.exBalf.的根及根莖，經筆者鑒定均為真品，購于四川省中藥材飲片公司；次烏頭堿對照品（上海東方藥品科技實業有限公司，批號：110798-200404，含量測定用）；鹽酸巴馬汀對照品（內標物，中國食品藥品檢定研究院，批號：110732-200506，含量測定用）；甲醇、甲酸均為色譜純，乙酸乙酯、氨水均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 動物

SD大鼠，SPF級，♂，體質量為230～250 g，購于四川省人民醫院實驗動物研究，許可證號：SCXK（川）2008-24。

2 方法與結果

2.1 藥液的制備

稱取黑順片100 g，用10 倍量水浸泡30 min，煮沸后微沸45 min，稱取大黃75 g浸泡30 min后，于黑順片煮沸45 min前15 min 下大黃，共同煎煮15 min，過濾，濾液濃縮至100 ml，得含黑順片1 g（生藥）/ml的黑順片-大黃合煎液。除不加入大黃外，其余按上述煎煮方法煎煮濃縮至100 ml，得1 g（生藥）/ml的黑順片單煎液。

2.2 給藥與取血方案

取大鼠，適應性喂養1 周后，隨機分為單用（黑順片單煎液）組和聯用（黑順片-大黃合煎液）組，每組18 只，ig 相應藥物，給藥劑量均以按黑順片計為10 g（生藥）/kg。分別于給藥前（0 h）和給藥后0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10 h經頸動脈插管處采血約0.3 ml，每個時間點取6只，置于預先肝素化的1.5 ml離心管中，以離心半徑6.5 cm（下同）、4 000 r/min離心5 min，取上層血漿樣品，于－20 ℃保存。

2.3 血漿樣品的處理

取血漿樣品160 μl，加入20 μl 內標鹽酸巴馬汀溶液（800 ng/ml），混勻，加入16 μl氨水堿化后，混勻；加入5倍量的乙酸乙酯渦旋8 min，于4 ℃下4 000 r/min 離心5 min，取上清液在38 ℃水浴條件下氮氣流吹干；殘渣用80 μl 50%甲醇溶解，進樣測定。

2.4 檢測條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18110A（100 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B）（含0.1%甲酸）（28∶72，V/V）；流速：0.2 ml/min；進樣量：5 μl；柱溫：30 ℃。

2.4.2 質譜條件 離子源：電噴霧電離（ESI），正離子模式（ESI+）選擇性離子監測（SIR）檢測。毛細管電壓：2.5 kV；錐孔電壓：45 V；二級錐孔電壓：1 V；六級桿透鏡電壓：0.5 V；ESI源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：300 ℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；錐孔氣流量：50 L/h。SIR 檢測：次烏頭堿m/z616.02，巴馬汀m/z352.31。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿+次烏頭堿、兩組大鼠ig 藥物后3 h 的血漿樣品，除空白血漿不加內標外其余均按“2.3”項下方法處理，進樣測定，記錄色譜。結果表明，大鼠血漿中的內源性物質對測定無干擾，次烏頭堿和巴馬汀的保留時間分別為20.45、7.49 min，二者分離度良好，響應值高。

2.5.2 線性關系考察 取1 μg/ml 的次烏頭堿對照品溶液，用甲醇逐級稀釋成質量濃度分別為0.819 2、1.638 4、4.096、10.24、25.6、64、160、400、800 ng/ml 的系列次烏頭堿標準溶液。取160 μl空白血漿，分別加入上述系列標準溶液20 μl，混勻后，按照“2.3”項下方法處理后，使次烏頭堿的終質量濃度分別為0.102 4、0.204 8、0.512、1.28、3.2、8、20、50、100 ng/ml，進樣測定，記錄峰面積。以次烏頭堿的質量濃度（x）為橫坐標、次烏頭堿與內標峰面積之比（y）為縱坐標進行加權（1/c2）最小二乘法計算，進行回歸分析。得回歸方程為y＝0.100 1x+0.086 1（r＝0.998 7），表明次烏頭堿檢測質量濃度的線性范圍為0.102 4～100 ng/ml；定量限為0.1 ng/ml（信噪比為10）。

2.5.3 基質效應與提取回收率試驗 取空白血漿160 μl，共15份，按“2.5.2”項下方法制成次烏頭堿質量濃度分別為0.2、3.2、85 ng/ml的血漿樣品，照“2.3”項下方法處理，每個濃度平行制備5份，進樣測定，得次烏頭堿與內標的峰面積比y1；取空白血漿160 μl，共15 份，按“2.3”項下方法處理后，加入次烏頭堿對照品溶液和內標溶液制備成含次烏頭堿質量濃度分別為0.2、3.2、85 ng/ml 的溶液，每個濃度平行制備5 份，進樣測定，得次烏頭堿與內標的峰面積比y2；取次烏頭堿質量濃度分別為0.2、3.2、85 ng/ml的對照品溶液，每個濃度平行5份，共15份，加入20 μl 內標溶液，進樣測定，得次烏頭堿與內標的峰面積比y3。以y1/y2計算提取回收率，以y2/y3計算基質效應。結果顯示，提取回收率和基質效應均在85.0%～106.0%之間，均符合生物樣品分析方法要求。

2.5.4 精密度試驗 分別取空白血漿160 μl，按“2.5.2”項下方法制成次烏頭堿質量濃度分別為0.2、3.2、85 ng/ml 的血漿樣品，照“2.3”項下方法處理，每個濃度平行制備5份，進樣測定，連續測定3 d。結果，日內RSD 為6.45%（n＝5），日間RSD 為8.36%（n＝3）。

2.5.5 穩定性考察 分別取空白血漿160 μl，按“2.5.2”項下方法制成次烏頭堿質量濃度分別為0.2、3.2、85 ng/ml 的血漿樣品，照“2.3”項下方法處理，每個濃度平行制備5 份，分別于室溫放置8 h、－20 ℃凍存1 d、反復凍融3次，考察穩定性。結果顯示，上述條件下次烏頭堿的RSD 均小于5.25%（n＝5）。

2.6 藥動學參數計算

取“2.2”項下各時間點的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣測定，記錄峰面積，繪制藥-時曲線。利用DAS2.0.1藥動學軟件計算藥動學參數。兩組大鼠體內次烏頭堿的藥-時曲線見圖1，藥動學參數見表1。

圖1 兩組大鼠體內次烏頭堿的藥-時曲線Fig 1 Blood concentration-time curves of hypaconitine in rats of 2 groups

表1 兩組大鼠體內次烏頭堿的藥動學參數（，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of hypaconitine in rats of 2 groups（，n＝6）

表1 兩組大鼠體內次烏頭堿的藥動學參數（，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of hypaconitine in rats of 2 groups（，n＝6）

注：與單用組比較，＊P＜0.05Note：vs.single drug group，＊P＜0.05

本實驗按黑順片生藥量的等劑量給藥，其中次烏頭堿在黑順片單煎液、黑順片-大黃合煎液中的含量分別為126、72.4μg/kg，用AUC與對應的次烏頭堿給藥劑量的比值表示大鼠體內次烏頭堿的吸收程度，由此可得黑順片單煎液、黑順片-大黃合煎液中次烏頭堿在大鼠體內的吸收程度分別為0.207、0.090 g/（ml·h）。

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。與單用組比較，聯用組大鼠體內次烏頭堿的t1/2、AUC0-10h、cmax均減?。≒＜0.05），吸收程度呈下降趨勢，說明大黃可以抑制次烏頭堿在大鼠體內的吸收，加快其在體內的消除。

3 討論

藥-時曲線顯示，次烏頭堿在60 min內達到濃度最高峰，達峰后又迅速降低，曲線逐漸緩和。這表明烏頭類生物堿在大鼠體內吸收較為迅速，而且代謝速度較快。

本研究結果顯示，與給予黑順片水煎液相比，給予黑順片-大黃合煎液后大鼠體內次烏頭堿的AUC0-10h和cmax均降低（P＜0.05），且其吸收程度下降。雖然有報道中藥之間配伍有吸收增強的結果[2-3]，但也有研究報道通過配伍后藥物中的有效成分減少[4-5]，尤其是有毒的中藥，這與本研究結果一致。

目前，大多都是用藥效學或化學的角度研究黑順片配伍大黃減毒的機制[6-7]，然而從藥動學角度研究有毒中藥配伍機制的較少。本實驗從藥動學的角度研究了其減毒的機制發現，大黃會抑制次烏頭堿在大鼠體內的吸收，加快其在體內的消除，其具體機制還需進一步深入研究。

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