星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化重樓皂苷類成分的提取工藝Δ

鞠建峰，朱宗敏，杜忠科（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，濟(jì)南 250014）

重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmithvar.yunnanensis或七葉一枝花Paris polyphylla var.chinensis的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，臨床主要用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、跌撲傷痛、驚風(fēng)抽搐[1]。現(xiàn)代研究表明，重樓具有止血、抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用[2-3]，其主要活性成分為甾體皂苷類成分[4]。

目前對重樓皂苷類成分的提取工藝主要是采用正交試驗(yàn)設(shè)計法進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)選，但正交試驗(yàn)設(shè)計法試驗(yàn)精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性較差[5]。故本研究采用試驗(yàn)精密度較高、預(yù)測值更接近真實(shí)值的星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選重樓總皂苷的提取工藝，以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化重樓皂苷的提取工藝參數(shù)，為重樓藥材的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜（HPLC）儀（美國安捷倫公司）；TG-16型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AB135-S型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；UV2600型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

重樓皂苷Ⅰ對照品（批號：111590-201103，純度：92.1%）、重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺?11591-201103，純度：93.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；重樓藥材（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥系李峰教授鑒定為云南重樓Paris polyphyllaSmithvar.yunnanensis干燥根莖）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ和重樓總皂苷的含量測定

2.1.1 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量測定[6-7]采用HPLC法。色譜條件：色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（48∶52），流速為1.0 ml/min；檢測波長為203 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。經(jīng)方法學(xué)考察，精密度、準(zhǔn)確度、線性關(guān)系、專屬性和靈敏度均符合要求。

2.1.2 重樓總皂苷的含量測定[8]采用可見分光光度法。以重樓皂苷Ⅰ為對照品，高氯酸為顯色劑，水浴65 ℃加熱15 min，在408 nm波長下測定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算供試品中重樓總皂苷的含量。經(jīng)方法學(xué)考察，精密度、準(zhǔn)確度、線性關(guān)系均符合要求。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 取重樓藥材6 份，每份50 g，稱定，分別加6 倍量（體積質(zhì)量比，ml/g）的水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇回流提取60 min，提取1次，濾過，測定提取液中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的含量，并計算其提取率（提取率＝提取所得浸膏質(zhì)量×浸膏中所測成分的含量/原藥材中所測成分的含量×100%），結(jié)果見表1。

表1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下重樓皂苷類成分的提取率（%）Tab 1 The extraction rate of saponins from P.polyphylla under the condition of different volume fractions of ethanol（%）

由表1可知，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對重樓皂苷類成分提取影響較大，因此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～80%進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計篩選。

2.2.2 提取時間的選擇 取重樓藥材6份，每份50 g，稱定，加6倍量60%乙醇，分別回流提取20、40、60、80、100、120 min，濾過，測定提取液中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的含量，并計算其提取率，結(jié)果見表2。

表2 不同提取時間下重樓皂苷類成分的提取率（%）Tab 2 The extraction rate of saponins from P.polyphylla under the condition of different extraction time（%）

由表2 可知，各提取時間對提取效果影響較大，故確定對所有提取時間范圍（20～120 min）進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計篩選。

2.2.3 溶劑倍量的選擇 取重樓藥材6份，每份50 g，稱定，分別加4、6、8、10、12倍量的60%乙醇回流提取60 min，濾過，測定提取液中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的含量，并計算其提取率，結(jié)果見表3。

表3 不同溶劑倍量下重樓皂苷類成分的提取率（%）Tab 3 The extraction rate of saponins from P.polyphylla under the condition of different amount of solvent（%）

由表3 可知，各溶劑倍量均對提取效果有影響，確定選取4～12倍量進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計篩選。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選重樓皂苷提取工藝

2.3.1 星點(diǎn)設(shè)計 為了更精確地考察最優(yōu)因素水平值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、提取時間（X2）和溶劑倍量（X3）為自變量，以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的提取率作為評價指標(biāo)。由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，并從節(jié)約成本和工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際考慮，將提取次數(shù)定為2次。同時為了將所有指標(biāo)綜合成一個能反映總體效應(yīng)結(jié)果的值，試驗(yàn)中以“總評歸一值”（Overall desirability，OD）來考察指標(biāo)的綜合效果，根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]的方法對各個指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理。各指標(biāo)由公式（1）計算di值：di＝（Yi－Ymin）/（Ymax－Ymin），其中Yi為實(shí)測值，Ymin和Ymax系指每一指標(biāo)在不同次試驗(yàn)中測得的所有值中的最小和最大值。計算出各指標(biāo)的di值后，由公式（2）計算OD 值：OD＝（d1×d2……×dn）1/n，n為指標(biāo)數(shù)。根據(jù)Central-Composite的中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理對各因素進(jìn)行5 水平設(shè)計，用代碼值－α、－1、0、1、α來表示，見表4；試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果見表5。

表4 Central-Composite試驗(yàn)設(shè)計因素與水平Tab 4 Factors and levels of Central-Composite design

表5 Central-Composite 試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Tab 5 Arrangement and results of Central-Composite design

2.3.2 模型擬合及方差分析 將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行效應(yīng)面試驗(yàn)分析，以O(shè)D值分別對各因素X（自變量）進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合。結(jié)果，多元線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)（r＝0.654 2）較低，變量之間線性相關(guān)性較差，擬合度不佳，預(yù)測性較差。其中，二項(xiàng)式方程擬合回歸方程為OD＝0.42+0.23X1+0.12X2+0.035X3+0.055X1X2+0.031X1X3－0.021X2X3+9.8×10－3X12－0.093X22－0.036X32（r＝0.924 0），相關(guān)系數(shù)較高，擬合度較好，預(yù)測性較好。方差分析結(jié)果見表6。

表6 效應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Tab 6 Results of variance analysis of the fitting regression equation with the response surface

由表6 可知，二項(xiàng)式回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著，說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾較小；模型擬合檢驗(yàn)顯著，說明方程與實(shí)際情況擬合良好，為成功模型；乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間對OD值的影響具有極顯著意義，所有交互項(xiàng)未達(dá)顯著性。

2.3.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 應(yīng)用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行三維效應(yīng)面圖，詳見圖1。

圖1 各因素對OD 值的效應(yīng)面圖Fig 1 Response surface of factors to OD value

由OD 值較高的水平確定最優(yōu)提取條件：X1為80%，X2為100.91 min，X3為10.18 倍（ml/g），OD 最大預(yù)測值為0.986 0。根據(jù)擬合的二項(xiàng)式回歸方程，得出優(yōu)化條件。鑒于試驗(yàn)操作的可行性，確定最優(yōu)工藝條件為加入80%乙醇10倍量（ml/g），回流提取2次，每次100 min。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 依據(jù)最優(yōu)工藝條件，取重樓藥材3 份，每份50 g，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，將測定的平均結(jié)果與擬合方程的預(yù)測值進(jìn)行比較，并計算偏差率[偏差率＝（預(yù)測值－實(shí)測值）/預(yù)測值×100%]。結(jié)果，重樓皂苷Ⅰ提取率分別為85.4%、82.7%、87.1%；重樓皂苷Ⅱ提取率分別為85.9%、81.3%、83.6%；重樓總皂苷提取率分別為89.5%、92.1%、90.3%；OD 實(shí)測平均值0.964 9。預(yù)測重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ及重樓總皂苷提取率分別為86.2%、84.7%、90.9%，OD 預(yù)測值為0.986 0，偏差率為2.14%，說明二項(xiàng)式擬合效果良好，所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，所選工藝條件重現(xiàn)性較好。

3 討論

重樓藥材中含有多種皂苷成分，有重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等[3]。本研究選用含量較高的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ作為指標(biāo)，采用HPLC 法進(jìn)行含量測定，同時采用分光光度法測定總皂苷含量，評價指標(biāo)全面，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

參考2010年版《中國藥典》重樓藥材項(xiàng)下重樓皂苷含量測定方法[1]，對重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ含量測定方法進(jìn)行了考察，確定了其最優(yōu)流動相比例：乙腈-水（48∶52）。在此條件下重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ峰形良好，達(dá)到基線分離，保留時間適中，檢測方便。

通過單因素試驗(yàn)考察了提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑倍量等因素的影響，為星點(diǎn)設(shè)計試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際和成本，將提取次數(shù)定為2 次，結(jié)果皂苷類成分基本提取完全。由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，因此未在星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法中對其進(jìn)行優(yōu)化。

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