補陽還五湯對腦缺血模型大鼠血清中CD40 和CD40L 含量的影響Δ

朱永坤，黃志恩，潘春予，姚 暉#，黎鉆弟，陳 艷（.東莞市第三人民醫院藥學部，廣東東莞 56；.佛山市第二人民醫院藥學部，廣東佛山 58000；.浙江工業大學藥學院，杭州 004）

補陽還五湯出自清代王清任的《醫林改錯》，處方為生黃芪120 g、當歸尾6 g、赤芍4.5 g、地龍3 g、桃仁3 g、紅花3 g、川芎3 g，具有益氣、活血、通絡等作用，可改善腦缺血局部微循環，減輕腦水腫及氧自由基損傷，促進神經功能恢復，是治療腦梗死和腦梗死后遺癥的經典名方[1-2]。腦卒中是我國的第一大死因，經統計2010年我國就有170萬人死于腦卒中[3]。腦卒中事件中約80%的患者為缺血性卒中患者，主要表現為動脈粥樣硬化性和血栓形成，引起管腔狹窄或閉塞后腦部血液供應障礙，導致腦組織缺血、缺氧性壞死。腦卒中具有高發病率、高致殘率等特點，治療費用高，對患者、患者家庭和社會均造成沉重的負擔。有研究表明，動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的主要病理基礎，而CD40 和CD40 配體（CD40L）細胞因子主要參與調控免疫、炎癥、氧化應激、高凝等諸多病生理狀態，在動脈粥樣硬化的發生、發展和斑塊破裂等環節中發揮著重要的作用[4]。本文即采用局灶性腦缺血大鼠模型，研究補陽還五湯對腦缺血模型大鼠血清中CD40和CD40L含量的影響，探討其對急性腦梗死損傷的保護機制。

1 材料

1.1 儀器

HSS-1 數字式超級恒溫浴槽（成都儀器廠）；BP121S 電子天平（德國Sartorius 公司）；醫用低溫電冰箱（日本Hitachi 公司）；Eclipse Ti熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；MQX200微孔板掃描酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；低速控溫離心機（美國Thermo公司）。

1.2 藥品與試劑

補陽還五湯顆粒劑（廣東一方制藥有限公司，批號：312506T，規格：2.0 g ∶10 g）；硫酸氫氯吡格雷片[賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號：2A183，規格：每片75 mg]；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（美國Sigma 公司）；10%水合氯醛（上海白鶴化工廠）；大鼠CD40、CD40L酶聯免疫吸附試劑盒（美國RB公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

2 方法

2.1 模型的復制與評價

采用大腦中動脈線栓（MCAO）法[5]復制大鼠局灶性腦缺血模型。大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）ip 麻醉，仰位固定后，頸正中切口，鈍性分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA），并分離迷走神經。由CCA分叉處向頭端依次游離，并結扎右側CCA近心端、ECA及其所有分支動脈，使其主干游離備用。然后分離右側ICA，沿ICA 向下分離翼腭動脈，根部結扎該分支，僅保留ICA入顱骨主干。在ECA近端備線，用無損傷動脈夾暫時夾閉其遠端，CCA分叉處做一切口，插入4～0 尼龍線，推進17～20 mm 時可感阻力，表明栓線頭端已經通過大腦中動脈（MCA）的起始處，阻斷MCA部分血流來源，縫合皮膚，此時即完成一側MCAO。假手術組除不插線外，其余步驟同上。術后將大鼠置于鋪好清潔墊料的飼養箱內自由飲水進食。分別于術后4、8、24 h對大鼠進行神經功能評分，根據Zea Longa 的五分制評分標準[5]，最高分為5分。0 分：無神經損傷癥狀；0.5 分：豎毛，輕度運動障礙；1 分：不能伸展對側前爪，運動障礙；2分：行動不協調，屈曲姿勢，旋轉運動；3分：向對側傾倒；4分：痙攣，昏睡，意識喪失；5分：死亡。分數越高，動物行為障礙越嚴重。當評分符合2、3、4 分，并且與正常大鼠存在明顯差異，則可證明模型復制成功。

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機分為假手術（生理鹽水）組、模型（生理鹽水）組、陽性對照[硫酸氫氯吡格雷6.75 mg/（kg·d）]組和補陽還五湯高、低劑量[26、6.5 g/（kg·d）]組，每組20 只。各組大鼠按“2.1”項下方法復制模型，術后第2 天開始分別按體表面積等效量換算比率計算人臨床常用劑量的2、0.5倍ig相應藥物，給藥體積為10 ml/kg，連續給藥14 d。

2.3 指標檢測

2.3.1 大鼠的精神狀態和一般狀況 給藥期間密切觀察各組大鼠精神狀態、活動情況，每周稱體質量，記錄神經功能評分和體質量變化。

2.3.2 大鼠腦組織病理學變化 取每組大鼠3～4 只，處死后取腦組織以4 ℃冰生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙吸干，先放在10%的中性福爾馬林里泡24 h后制成病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后于Eclipse Ti 熒光倒置顯微鏡下觀察腦組織的病理學變化。

2.3.3 大鼠血清中CD40 和CD40L 含量 各組大鼠末次給藥后2 h，腹主動脈取血約5 ml，3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心30 min，吸取上層血清于－20 ℃下保存。采用酶聯免疫吸附法，按試劑盒操作檢測各組大鼠血清中CD40、CD40L含量。

2.4 統計學處理

采用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析。各組數據以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠神經功能評分

術后4 h，與假手術組比較，各組大鼠清醒后表現出明顯的神經運動功能障礙，提鼠尾可見其左前肢收緊貼胸壁，左側肢體肌力下降，行走時偏向左側，各組大鼠嚴重程度相似。術后8、24 h后，大鼠死亡率大大增加。術后1 d，各組大鼠神經功能評分為2～4分，并與正常大鼠存在明顯差異。綜合考慮，每組選取6只大鼠進行后續給藥實驗。

連續給藥14 d 后，假手術組、模型組、陽性對照組和補陽還五湯高、低劑量組大鼠的神經功能評分分別為0、（0.25±0.53）、（1.6±0.69）、（1.5±0.53）、（2.3±0.48）分。與假手術組比較，模型組大鼠的神經功能評分增加；與模型組比較，陽性對照組和補陽還五湯高、低劑量組大鼠的神經功能評分減少，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

3.2 大鼠的一般狀況

模型組大鼠一般狀態較差，活動較少，大多數體質量下降。與模型組比較，補陽還五湯高劑量組和陽性對照組大鼠上述癥狀有不同程度地改善，體質量增加，給藥第7～14 天時體質量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。

3.3 大鼠腦組織病理學變化

假手術組大鼠腦組織內神經元細胞、膠質細胞、血管均形態正常、結構完整，細胞密度大，間質無水腫；神經元胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，無神經變性壞死等病理改變。模型組大鼠病灶側腦組織神經元、膠質細胞的細胞間隙和細小血管間隙顯著增寬，神經細胞呈空泡樣變，細胞數量減少、丟失，皮質深層神經元胞漿及胞膜形態不規則、邊界不清，呈缺血樣病理改變。陽性對照組大鼠病灶側腦組織神經元、膠質細胞的細胞間隙和細小血管間隙部分增寬，皮質深層神經元胞漿及胞膜形態相對規則，缺血灶減少。補陽還五湯高劑量組大鼠病灶側腦組織神經元、膠質細胞的細胞間隙和細小血管間隙較顯著增寬，神經纖維網呈空泡樣變，但較模型組有改善。補陽還五湯低劑量組大鼠病理改變與模型組相似。各組大鼠腦組織的病理切片圖見圖1。

3.4 大鼠血清中CD40、CD40L含量變化

圖1 各組大鼠腦組織的病理切片圖（HE，×200）Fig 1 Pathological sections of brain tissues of all groups of rats（HE，×200）

與假手術組比較，模型組大鼠血清中CD40、CD40L 含量均增加；與模型組比較，陽性對照組和補陽還五湯高劑量組大鼠血清中CD40L 含量均減少，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），其余差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠血清中CD40、CD40L含量的測定結果見表1。

表1 各組大鼠血清中CD40、CD40L 含量的測定結果（，n＝6，ng/ml）Tab 1 Contents of CD40 and CD40L in the serum of all groups of rats（，n＝6，ng/ml）

表1 各組大鼠血清中CD40、CD40L 含量的測定結果（，n＝6，ng/ml）Tab 1 Contents of CD40 and CD40L in the serum of all groups of rats（，n＝6，ng/ml）

注：與假手術組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham-operation group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

4 討論

腦缺血后，梗死中心區的腦細胞產生大量的炎性介質，釋放自由基和細胞毒性物質，誘導中性粒細胞和內皮細胞黏附，介導缺血瀑布反應[6-7]。其中在急性腦缺血時，炎癥反應可能對機體的轉歸和預后造成不良的影響[8]，在缺血性腦卒中的發生、發展過程中也起著重要的作用。本課題組多年來對補陽還五湯對血小板活化因子（PAF）的體內外影響做了大量的研究工作，探討了該方對血小板功能以及PAF代謝、受體活性等的影響，揭示了該方能夠通過降低體內PAF含量、抑制PAF受體活性和血小板聚集等作用而抑制血栓形成[9-13]。近年來研究發現，補陽還五湯對腦組織的保護作用可能與抑制局部炎癥反應、降低炎癥因子等水平密切相關[14-15]。

CD40-CD40L 作為炎性和免疫反應中的重要信號轉導系統通路，參與調控免疫、炎癥、高凝等多種病生理狀態，可激活炎癥反應、活化血小板，導致內皮功能障礙等[16]，在炎癥反應中具有重要的調節功能。多項研究證實，CD40-CD40L 系統通路在動脈粥樣硬化性腦梗死疾病發生和發展的各個階段均起著重要的作用。其中，CD40L[16-17]（即CD154）是一種Ⅱ型跨膜蛋白（39 kD的跨膜糖蛋白），屬于腫瘤壞死因子α（TNF-α）超家族，主要表達于活化的CD4+T細胞和血小板。CD40蛋白[17]是一種Ⅰ型跨膜受體，屬于腫瘤壞死因子受體（TNF-R）超家族，在B細胞膜表面、其他免疫細胞、上皮細胞、皮纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、血小板上均有表達。當CD40 被CD40L 所激活后即啟動炎癥反應信號傳導，導致轉錄因子NF-κB激活，誘導促炎細胞因子產生，增加黏附分子和基質金屬蛋白酶（MMPs）等表達[18]。因此，CD40-CD40L 系統通路和腦缺血后炎癥反應的關系密切，針對腦缺血后炎癥反應CD40-CD40L系統通路的研究也逐漸成為新藥開發的研究靶點[16]。血清中CD40L 是由活化血小板膜上脫落后形成的可溶性形式，據估計血清中的CD40L 約95%來自血小板[18-19]，其可啟動內皮細胞的多種炎癥反應。血清CD40L水平的升高是血小板活化和不穩定斑塊的標志，對心腦血管事件的發生是一個有效的、獨立的預測指標。

本研究發現，補陽還五湯對MACO 術后腦缺血模型大鼠腦組織細胞有保護作用，表現為與模型組比較，陽性對照組和補陽還五湯高劑量組血清中CD40L的含量均顯著降低。補陽還五湯高劑量能顯著降低CD40L 含量水平，從而可導致血小板活化水平下降，這與課題組前期發現補陽還五湯能顯著抑制PAF活性結果相一致。另外，陽性對照組和補陽還五湯高、低劑量組血清中CD40含量與模型組比較無統計學差異，其原因可能是CD40主要表達于血小板、B細胞等免疫細胞膜表面，酶聯免疫吸附所檢測的血清中已除去免疫細胞和血小板，而血清中存在的CD40含量較低，以致組間差異不大。

綜上，本研究證實補陽還五湯能改善腦缺血模型大鼠腦組織形態、減輕腦缺血組織損傷，其機制可能與降低CD40L含量有關。

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