側柏葉水煎液對耳廓炎癥和腹腔炎癥模型小鼠的抗炎作用

李 麗，苗文靜，王 青（1.濟寧醫學院基礎醫學教研室，山東日照 7686；.日照市婦幼保健院檢驗科，山東日照 7686；.日照市人民醫院，山東日照 7686）

急性炎癥為較常見的病理過程，其常伴隨多種疾病，并對多種疾病的發生和演變產生重要影響。隨著人們對安全、高效藥物需求的增長，天然藥物在抗炎方面的研究已備受關注。側柏葉為柏科植物的嫩枝葉，呈鱗片狀，質地松脆，氣微香，味苦澀。古籍記載側柏葉有涼血止血、生發烏發、止咳喘的功效[1]，但目前鮮有側柏葉抗炎作用的研究。

急性炎癥由致炎因子引起，其起病急驟、維持時間較短，以滲出性病變為特征。細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）及白細胞介素-1（IL-1）等在急性炎癥發病過程中發揮了重要調節作用[2]。酸敏感離子通道（ASICs）為非電壓門控的高度通透的Na+離子通道，酸敏感離子通道1a（ASIC1a）是ASICs的一種亞型，均由細胞外酸化激活[3-4]。急性炎癥時常伴有組織酸化，ASIC1a易被激活。已有研究表明，在氟氏完全佐劑誘導的小鼠關節炎模型中，關節軟骨ASIC1a表達明顯增加[5]。因此在本研究中，首先通過小鼠耳部涂抹二甲苯及腹腔注射0.6%醋酸制備小鼠耳廓炎癥及腹腔炎癥模型，觀察側柏葉水煎液能否減輕耳部腫脹及增加腹腔血管通透性，以期探討其抗急性炎癥作用；然后檢測側柏葉水煎液對急性耳部炎癥時血清TNF-α、IL-1水平及急性腹腔炎癥時肝組織TNF-α、IL-1及ASIC1a含量的影響，以期探討其抗急性炎癥的相關機制。

1 材料

1.1 儀器

DNM-9602自動酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）；UV-6000 紫外分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）；GT10-1高速離心機（北京時代北利離心機有限公司）；RE-5299旋轉蒸發儀（上海錦岐儀器設備有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

新鮮側柏葉取自濟寧醫學院校內中藥種植園，摘除大的枝干，只留針尖葉，經筆者鑒別為真品；阿司匹林片（神威藥業有限公司，批號：1309072，規格：每片25 mg）；TNF-α酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：20140211）、IL-1 ELISA 試劑盒（批號：20140322）及ASIC1aELISA 試劑盒（批號：20140331）均為美國R&D Systems公司進口分裝。

1.3 動物

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 側柏葉水煎液 取新鮮側柏葉200 g，用剪刀剪為5 cm左右的細小枝葉，按質量比1 ∶7的比例加水煎煮3次，每次1.5 h。合并煎液，用抽濾裝置濾過，濾液用旋轉蒸發儀于60 ℃下濃縮成清膏，按1 g（生藥）/L放冷，置于4 ℃冰箱貯存。

2.1.2 阿司匹林混懸液 取阿司匹林片于研缽研碎，加蒸餾水溶解稀釋成0.25 g/L的溶液。

2.2 分組與給藥

取小鼠120 只，分成2 批，每批各取60 只分別用于觀察側柏葉水煎液對小鼠耳廓炎癥模型和腹腔炎癥模型的影響。2批小鼠均隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照（阿司匹林0.25 g/L）組和側柏葉高、中、低劑量[1、0.5、0.25 g（生藥）/L]組，依次記為A、B、C、D、E、F組，每組10只。前期研究表明，1 g（生藥）/L 側柏葉水煎液與0.25 g/L 阿司匹林的抗炎效果相似，因此為考察低于1 g（生藥）/L的側柏葉水煎液是否也具有較強的抗炎效果，故將1 g（生藥）/L 側柏葉水煎液經稀釋制成1、0.5、0.25 g（生藥）/L。適應性喂養小鼠3 d后，連續ig相應藥物5 d，給藥體積為0.02 ml/g。

2.3 抗耳廓炎癥作用的考察

取“2.2”項下第一批6 組小鼠，除A 組小鼠涂抹等量生理鹽水外，其余各組小鼠末次給藥30 min 后左耳外耳廓雙面涂抹二甲苯50 μl復制炎癥模型，右耳不涂作為正常耳對照。左耳耳廓涂抹1 h后眼球取血1 ml，以離心半徑98.5 mm（下同）、3 000 r/min 離心10 min，取上清按試劑盒操作檢測血清中TNF-α、IL-1含量。取血后脫頸椎處死小鼠，用直徑7 mm的打孔器在左右耳相同位置打下耳片，于分析天平上稱質量并計算腫脹度和腫脹率。腫脹度＝致炎后左耳片質量－未致炎右耳片質量；腫脹率＝（致炎后左耳片質量－未致炎右耳片質量）/未致炎右耳片質量×100%。

2.4 抗腹腔炎癥作用的考察

取“2.2”項下第二批6 組小鼠，除A 組小鼠ip 等量生理鹽水外，其余各組小鼠末次給藥30 min 后上腹部和下腹部分兩次ip 0.6%醋酸溶液，每次給藥體積為0.02 ml/g。60 min 后脫頸椎處死小鼠，剪開腹腔，暴露并用剪刀剪取肝臟，用預冷磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4，下同）沖洗表面雜質，剪碎。取100 mg，放入微量手動玻璃勻漿器中，按體積比1 ∶9加入PBS于冰水中勻漿。吸取勻漿液至離心管，低溫5 000 r/min離心5 min，取上清按試劑盒操作檢測肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量。與此同時，對各組小鼠用5 ml生理鹽水分數次灌洗腹腔，收集灌洗液，2 500 r/min 離心5 min，取上清。由于蛋白質結構中的肽鍵在遠紫外區（200～250 nm）有光吸收的峰值，光吸收強弱在一定范圍內與濃度成正比，且波長越短光吸收越強。用215 nm 和225 nm 光吸收差值與單一波長測定相比，可減少非蛋白質成分引起的誤差，且差值大小與蛋白質濃度呈正相關[6]。因此，用紫外分光光度計，以生理鹽水作為標準液，于215 nm 和225 nm 處比色，測定并計算光密度差值（ΔA＝A215nm－A225nm），以此比較各組的蛋白質濃度。

2.5 統計學處理

3 結果

3.1 對耳廓炎癥的影響

3.1.1 血清中TNF-α、IL-1 含量 與A 組比較，B 組小鼠血清中TNF-α、IL-1含量增加；與B組比較，C、D、E、F組小鼠血清中TNF-α、IL-1含量減少；與C組比較，E、F組小鼠血清中TNF-α、IL-1 含量增加，以上差異均有統計學意義（P＜0.05）。各組耳廓炎癥模型小鼠血清中TNF-α、IL-1含量的測定結果見表1。

表1 各組耳廓炎癥模型小鼠血清中TNF-α、IL-1含量的測定結果（，n＝10）Tab 1 Contents results of TNF-α and IL-1 in serum in all groups of mice with auricle inflammation（，n＝10）

表1 各組耳廓炎癥模型小鼠血清中TNF-α、IL-1含量的測定結果（，n＝10）Tab 1 Contents results of TNF-α and IL-1 in serum in all groups of mice with auricle inflammation（，n＝10）

注：與A 組比較，＊P＜0.05；與B 組比較，#P＜0.05；與C 組比較，ΔP＜0.05Note：vs.group A，＊P＜0.05；vs.group B，#P＜0.05；vs.group C，ΔP＜0.05

3.1.2 腫脹度及腫脹率 與B 組比較，C、D、E、F 組小鼠的耳廓腫脹度和腫脹率降低；與C 組比較，E、F 組小鼠的耳廓腫脹度增加，D、E、F組小鼠的耳廓腫脹率增加，以上差異均有統計學意義（P＜0.05）。各組小鼠耳廓腫脹度和腫脹率的測定結果見表2。

表2 各組小鼠耳廓腫脹度和腫脹率的測定結果（，n＝10）Tab 2 Results of swelling degree and swelling rates in all groups of mice（，n＝10）

表2 各組小鼠耳廓腫脹度和腫脹率的測定結果（，n＝10）Tab 2 Results of swelling degree and swelling rates in all groups of mice（，n＝10）

注：與B組比較，＊P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05Note：vs.group B，＊P＜0.05；vs.group C，#P＜0.05

3.2 對腹腔炎癥的影響

與A 組比較，B 組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA均增加；與B 組比較，C、D、E、F 組小鼠TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA降低；與C組比較，F組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA均增加，以上差異均有統計學意義（P＜0.05）。各組腹腔炎癥模型小鼠肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA的測定結果見表3。

表3 各組腹腔炎癥模型小鼠肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA的測定結果（，n＝10）Tab 3 Contents of TNF-α，IL-1 and ASIC1ain liver tissues as well as ΔA in all groups of mice with abdominal inflammation（，n＝10）

表3 各組腹腔炎癥模型小鼠肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA的測定結果（，n＝10）Tab 3 Contents of TNF-α，IL-1 and ASIC1ain liver tissues as well as ΔA in all groups of mice with abdominal inflammation（，n＝10）

注：與A 組比較，＊P＜0.05；與B 組比較，#P＜0.05；與C 組比較，ΔP＜0.05Note：vs.group A，＊P＜0.05；vs.group B，#P＜0.05；vs.group C，ΔP＜0.05

4 討論

4.1 側柏葉水煎液抗急性耳廓及腹腔炎癥的作用

急性炎癥是由致炎因子導致的，以滲出性病變為特征，起病急驟、維持時間較短的病理變化[7]。二甲苯和醋酸都是化學類的致炎因子，因此在本研究中，小鼠左耳涂抹二甲苯導致左耳毛細血管滲出增加，從而引起左耳明顯腫脹；小鼠腹腔注射0.6%醋酸后毛細血管通透性增加，血漿蛋白滲出到毛細血管外。因此與A組相比，B、C、D、E、F組小鼠腹腔灌洗液ΔA值明顯增大，提示本研究建模成功。與B組相比，C、D、E、F組小鼠左耳腫脹度和腫脹率明顯降低，腹腔灌洗液ΔA值明顯降低，提示側柏葉水煎液和阿司匹林有明顯降低急性炎癥導致的毛細血管通透性增加的作用，且側柏葉水煎液濃度越高，其抗炎作用越明顯。

4.2 側柏葉水煎液抗急性炎癥作用的相關機制

急性炎癥時，致炎因子可以刺激機體合成和分泌細胞因子，從而引起毛細血管滲出、組織腫脹、低血壓、發熱等不良作用[8]。而TNF-α是眾多細胞因子中最早出現的一種，其可以刺激IL 等其他細胞因子的合成與釋放，進而引起細胞損傷[9]。Dorofeeva NA等[10]研究發現，在分離的海馬神經元中ASIC1a表達在致炎后明顯增加，非甾體類消炎藥能明顯降低ASIC1a的表達，提示ASIC1a與炎癥的發生也密切相關。本研究顯示，在二甲苯和醋酸誘導的小鼠急性炎癥模型中，其血清TNF-α和IL-1含量明顯增加，肝組織TNF-α、IL-1和ASIC1a含量明顯增加，提示二甲苯導致的耳廓腫脹、醋酸引起的腹腔血管通透性增加和肝臟的腫脹可能與TNF-α、IL-1和ASIC1a等因素有關。而側柏葉水煎液能明顯降低由二甲苯所致的血清TNF-α和IL-1 含量的增加以及醋酸所致的肝組織TNF-α、IL-1和ASIC1a含量的增加，提示側柏葉水煎液的抗炎作用與降低TNF-α、IL-1 和ASIC1a等有關。

[1]曹雨誕，曾祥麗，單鳴秋，等.側柏葉的研究進展[J].江蘇中醫藥，2008，40（2）：86.

[2]張莉，哈木拉提·吾甫爾.細胞因子在神經-內分泌-免疫網絡中的調節機制[J].免疫學雜志，2006，22（3）：128.

[3]李麗.酸敏感離子通道在中樞化學感受器呼吸調節中的作用[J].中國病理生理雜志，2014，30（8）：1 400.

[4]蔣莉婭.酸敏感離子通道表達的研究進展[J].現代中西醫結合雜志，2011，20（16）：2 069.

[5]林梅英，陳飛虎，葛金芳，等.鬼針草總黃酮對急性炎癥的保護作用及可能機制的研究[J].中國臨床藥理學與治療學，2013，18（6）：614.

[6]陳鈞輝.生物化學實驗[M].4版.北京：科學出版社，2008.

[7]李玉林.病理學[M].8版.北京：人民衛生出版社，2013.

[8]崔巖，栗紅蕊，孫高潔，等.利拉魯肽對肥胖大鼠體質量、血脂水平和下丘腦炎癥通路的影響研究[J].中國藥房，2014，25（17）：1 571.

[9]方劍喬，劉芳，邵曉梅.電針對角叉菜膠致炎大鼠的抗炎效應及對白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α的影響[J].針刺研究，2007，32（4）：224.

[10]Dorofeeva NA，Barygin OI，Staruschenko A，et al.Mechanisms of non-steroid anti-inflammatory drugs action on ASICs expressed in hippocampal interneurons[J].J Neurochem，2008，106（1）：429.