維藥恰瑪古中硫代葡萄糖苷的提取工藝研究Δ

張 濤，安熙強，黃 莉，胡 旭，程江南，趙婷婷，馬 媛，張 娟（.新疆維吾爾自治區藥物研究所，烏魯木齊 830004；.新疆維吾爾自治區第二濟困醫院，烏魯木齊 8300）

恰瑪古，拉丁文名Brassica rapaL.，為十字花科蕓薹屬蕪菁亞種，二年生草本植物，常用種子和根入藥。恰瑪古是受新疆維吾爾族喜愛的并有較長應用歷史的傳統藥用植物[1-3]，收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準-維吾爾藥分冊》中[4]。其主產于中國新疆天山西南、塔里木西北地區，其中新疆阿克蘇柯坪縣作為該物種的主產地，已獲得國家地理標志認證。

硫代葡萄糖苷是廣泛存在于十字花科植物中的含硫次級代謝產物，到目前已發現有近120種。硫代葡萄糖苷在芥子酶或胃腸道中細菌酶的催化作用下，會發生降解并生成多種降解產物。研究發現硫代葡萄糖苷的降解產物異硫代氰酸鹽具有抗腫瘤作用[5-7]。根據文獻報道，十字花科蕓薹屬植物根系中的硫代葡萄糖苷以芳香族為主，主要是苯甲基硫代葡萄糖苷、p-羥基苯甲基硫代葡萄糖苷和2-苯乙基硫代葡萄糖苷[8]。因此，本研究選擇苯甲基硫代葡萄糖苷為對照品，以硫代葡萄糖苷提取量和干膏得率為綜合評價指標，通過單因素試驗篩選提取方法（乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取次數），利用正交試驗考察乙醇體積分數、料液比、提取時間對恰瑪古中硫代葡萄糖苷提取工藝的影響，并采用經方法學驗證后的紫外分光光度法測定硫代葡萄糖苷含量，為恰瑪古中硫代葡萄糖苷的充分利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV765 型紫外分光光度計（上海精科有限公司）；ML204型電子天平、AB135-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品、藥材與試劑

苯甲基硫代葡萄糖苷對照品（美國Chroma Dex 公司，批號：00007300-704，純度：99.3%）；恰瑪古（新疆柯坪縣圣泉實業有限公司，批號：141028，經新疆維吾爾自治區藥物研究所楊偉俊研究員鑒定為十字花科蕓薹屬蕪菁亞種恰瑪古的肉質根）；水為雙蒸水，試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 硫代葡萄糖苷含量測定[9-10]

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取苯甲基硫代葡萄糖苷對照品35.50 mg，置于25 ml量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為1.41 mg/ml的苯甲基硫代葡萄糖苷對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取恰瑪古藥材粗粉5 g 至燒瓶中，加8倍量85%乙醇回流提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液至100 ml量瓶中，用85%乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 檢測波長的選擇 精密吸取對照品溶液和供試品溶液2 ml，分別置于10 ml量瓶中，加入0.1%羧甲基纖維素鈉4 ml，搖勻后再加入0.71 g/L氯化鈀2 ml，搖勻，室溫顯色1 h。對照管以相應試劑為空白。于400～700 nm 波長掃描，結果顯示，二者均在520 nm波長處有最大吸收。

2.1.4 標準曲線的制備 精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5、6 ml置于10 ml量瓶中，按“2.1.3”項下方法測定吸光度（A），以A為縱坐標、對照品溶液質量濃度（c）為橫坐標，得回歸方程A＝1.019 8c－0.049 9（r＝0.999 9，n＝6），表明苯甲基硫代葡萄糖苷線性范圍為0.141～0.846 mg/ml。

2.1.5 重復性試驗 精密稱取恰瑪古藥材粗粉5 g，共6份，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下方法測定A，計算吸光度的RSD為0.94%（n＝6），表明本法重復性良好。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液3 ml，共5 份，按“2.1.3”項下方法測定A，計算吸光度的RSD 為0.27%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液2 ml，分別于1、2、3、4、5、6 h 按“2.1.3”項下方法測定A，計算硫代葡萄糖苷含量的RSD為2.78%（n＝6）。結果表明，供試品溶液在6 h內可保持相對穩定，但在4 h 后測定值明顯降低。因此，測定恰瑪古中的硫代葡萄糖苷含量時，要求在4 h 以內完成，以保證試驗結果的準確。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的恰瑪古藥材粗粉9份，平均分為3組，按高、中、低3個水平依次精確地加入一定量苯甲基硫代葡萄糖苷對照品溶液，然后按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下方法測定A，計算平均加樣回收率為98.96%，RSD為1.20%（n＝3）。

2.2 綜合評分計算

以硫代葡萄糖苷提取量和干膏得率進行綜合評分，硫代葡萄糖苷提取量（mg/g）＝提取液中硫代葡萄糖苷質量濃度×定容體積/原藥材的質量；干膏得率（%）＝干膏質量/原藥材的質量×100%，綜合評分＝（硫代葡萄糖苷提取量/硫代葡萄糖苷提取量最大值）×80+（干膏得率/干膏得率最大值）×20。

2.3 單因素試驗考察

根據硫代葡萄糖苷的理化性質，以及醇提工藝的主要影響因素，選取乙醇體積分數（%）、料液比、提取時間（h）、提取次數作為考察因素。

2.3.1 乙醇體積分數 精密稱取恰瑪古藥材粗粉25 g，共5份，分別加入8倍量95%、85%、75%、65%、55%的乙醇溶液加熱回流提取2 次，每次1 h，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定。計算得各提取液中硫代葡萄糖苷提取量分別為7.26、6.48、6.17、5.87、5.47 mg/g，干膏得率分別為25.17%、23.36%、23.19%、18.49%、18.25%。綜合評分結果見圖1。

由圖1 可見，隨著乙醇體積分數的降低，綜合評分逐漸降低，表明95%乙醇的提取效果最好。故選擇95%、85%和75%乙醇進一步進行正交試驗。

圖1 乙醇體積分數對綜合評分的影響Fig 1 The effects of ethanol volume fraction on the comprehensive score

2.3.2 料液比 精密稱取恰瑪古藥材粗粉25 g，共5 份，分別加入6、8、10、12、14 倍量95%乙醇加熱回流提取2 次，每次1 h，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定。計算得各提取液中硫代葡萄糖苷提取量分別為6.65、7.31、7.34、7.59、7.65 mg/g，干膏得率分別為19.88%、24.77%、25.81%、27.48%、27.82%。綜合評分結果見圖2。

圖2 料液比對綜合評分的影響Fig 2 The effects of material-liquid ratio on the comprehensive score

由圖2 可見，料液比大于1 ∶8 后，綜合評分趨于穩定。故選擇8倍量、10倍量和12倍量乙醇進一步進行正交試驗。

2.3.3 提取時間 精密稱取恰瑪古藥材粗粉25 g，共5 份，分別加入8倍量95%的乙醇溶液加熱回流提取2次，每次0.5、1、1.5、2、2.5 h，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定。計算得各提取液中硫代葡萄糖苷提取量分別為7.09、7.42、7.32、6.31、5.55 mg/g，干膏得率分別為24.36%、25.14%、25.13%、25.15%、25.20%。綜合評分結果見圖3。

圖3 提取時間對綜合評分的影響Fig 3 The effects of extraction time on the comprehensive score

由圖3 可見，當提取時間大于1.5 h 后，綜合評分逐漸降低。故選擇0.5、1、1.5 h進一步進行正交試驗。

2.3.4 提取次數 精密稱取恰瑪古藥材粗粉25 g，共4份，分別加入8倍量95%的乙醇溶液加熱回流提取1、2、3、4次，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定。計算得各提取液中硫代葡萄糖苷提取量分別為5.56、7.42、7.50、7.60 mg/g，干膏得率分別為19.25%、24.99%、24.90%、24.79%。綜合評分結果見圖4。

圖4 提取次數對綜合評分的影響Fig 4 The effects of extraction times on the comprehensive score

由圖4 可見，當提取次數大于2 次后，綜合評分為98 以上。為了充分提取藥材中的有效成分，又考慮到工業成本，最終確定提取次數為2次。

2.4 正交試驗優選提取工藝條件

在單因素試驗基礎上，固定提取次數為2 次，同時選擇乙醇體積分數、提取時間、料液比為考察因素，以硫代葡萄糖苷提取量和干膏得率的綜合評分為指標，按L9（34）正交表進行試驗。精密稱取恰瑪古藥材粗粉25 g，共9 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。因素與水平見表1，正交試驗安排及結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗安排及結果Tab 2 Orthogonal test arragement and its results

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

由直觀分析可知，各因素對恰瑪古硫代葡萄糖苷提取工藝的影響大小順序為A（乙醇體積分數）＞B（提取時間）＞C（料液比），以乙醇體積分數對恰瑪古中硫代葡萄糖苷提取效果的影響最大（P＜0.05）。經方差分析可知，提取時間、料液比對提取效果無顯著性影響。因此，為降低成本、節省工時，結合單因素試驗結果綜合考慮，確定最優工藝為A1B2C3，即乙醇體積分數95%，提取時間1.0 h，料液比1∶8。

2.5 正交驗證試驗

據正交試驗優選的提取工藝條件，進行3 次驗證試驗，結果見表4。

表4 驗證試驗結果Tab 4 Results of verification test

由表4可知，所優選出的提取工藝合理、穩定。

3 討論

目前，恰瑪古中硫代葡萄糖苷提取工藝主要選擇高溫水煎煮[11]，而在此條件下，硫代葡萄糖苷極易發生降解，引起成分變化[12]；并且之前有關工藝研究僅以硫代葡萄糖苷提取量為指標，未考慮提取條件對干膏得率的影響。因此，本研究在前期研究的基礎上，首先采用乙醇為提取溶劑，可以避免硫代葡萄糖苷在水提取過程中的降解損失問題；其次，本研究以恰瑪古中硫代葡萄糖苷提取量和干膏得率的綜合評分為指標，指標更全面、合理。

恰瑪古是新疆特色藥用植物資源，具有豐富的營養成分、顯著的保健作用、獨特的臨床效果和重要的經濟價值，應用前景廣闊[1-2]。當然，通過本工藝得到的是硫代葡萄糖苷粗提取物，故更進一步的研究是對硫代葡萄糖苷進行精制，或是對硫代葡萄糖苷及其他試驗條件等進行篩選，以進一步優化提取條件、提高提取效率，為開發以恰瑪古中硫代葡萄糖苷為藥用成分的系列產品提供優質原料。

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