HPLC法測定不同生長年限的葛根不同部位中葛根素的含量Δ

劉計權，宋 強，楊文珍，任劍鋒，宋曉春（山西中醫學院中藥學院，太原 030024）

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）的干燥根，味甘、辛、涼，歸脾、胃經，具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉、通經活絡、解酒毒等功效[1]。葛根的主要有效成分葛根素有多重藥理作用。現代藥理及臨床研究表明，葛根素具有明顯的擴張血管作用，臨床上廣泛應用于治療缺血性心肌病、腦血栓、視網膜動靜脈栓塞[2-3]，以及由糖尿病引起的微循環障礙等[4-8]。葛根有效成分的形成和積累，不僅受其遺傳基因、生長環境的影響，同時也與其生長年限、器官與組織部位有著密切關系[9]。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法測定了不同生長年限的葛根不同部位中葛根素的含量，以期為葛根藥材的規范化栽培和加工利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

515型HPLC儀，包括515型輸液泵、2996型紫外檢測器（美國Waters公司）；EL204型萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH.S21-6型數顯恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術有限公司）。

1.2 試劑

葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-200912）；甲醇為色譜純，乙醇為分析純，水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3 藥材

葛根藥材采自山西省平陸縣葛根種植基地，經山西中醫學院劉計權副教授鑒定為豆科植物野葛P.lobata（Willd.）的根和莖。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diakma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（25 ∶75，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：250 nm。高效液相色譜見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取葛根素對照品1.8 mg，置于10 ml量瓶中，加30%乙醇溶解并定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過后密封，得質量濃度為0.18 mg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取葛根樣品適量，粉碎，過3號篩，精密稱取約0.2 g，置于圓底燒瓶中，精密加入30%乙醇50 ml，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再次精密稱定，用30%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液1、3、5、8、11 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以葛根素的進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝768 452x－316 936（r＝0.999 8）。結果表明，葛根素的進樣量在0.18～1.98 μg范圍內與其峰面積積分值呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

取葛根素對照品適量，按“2.2.1”項下方法制備對照品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，葛根素峰面積的RSD為1.88%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取同一供試品溶液適量，分別于放置0、2、4、6、8、10 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，葛根素峰面積的RSD為1.08%，表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.6 重復性試驗

取同一批葛根樣品（一年生葛根韌皮部）約0.2 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，葛根素峰面積的RSD為2.39%，表明本方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的葛根樣品（一年生葛根韌皮部）約0.1 g，共6份，分別精密加入葛根素對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測定

分別取不同的葛根樣品粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，重復3次，記錄峰面積，計算葛根素的質量分數，結果見表2。

由表2可以看出，總體來講，木質部中葛根素的質量分數＞韌皮部＞莖部，木質部與韌皮部中葛根素的質量分數比較接近，而莖部質量分數顯著低于木質部與韌皮部；但二年生葛根韌皮部中葛根素的質量分數高于四、五年生葛根木質部。對于不同生長年限的葛根，木質部中葛根素的質量分數隨著生長年限有增長之勢；但到第三年時，質量分數達到最大，四到五年生葛根木質部中的質量分數有所下降；韌皮部中葛根素的質量分數與木質部呈現出相似的變化趨勢，但韌皮部中葛根素的質量分數從第3年就開始有所下降；葛根莖部中葛根素的質量分數隨著生長年限的增長一直呈現增長趨勢。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

筆者在進行樣品提取時發現，葛根韌皮部提取液的顏色較木質部深，但含量測定結果顯示木質部中葛根素的平均質量分數高于韌皮部，可見提取液顏色的深淺與質量分數沒有必然聯系。

在提取過程中考慮到不同浸泡時間可能會導致葛根素在乙醇中的浸出率不同，為此筆者進行了不同浸泡時間（直接提取、浸泡20 min、浸泡40 min）對葛根素質量分數影響的對比研究。結果，葛根素的質量分數分別為2.91%、2.93%和2.94%，以浸泡40 min后葛根素的質量分數最高，但差異不大。考慮到提取效率，本研究最終確定采用直接提取的方式。

同一生長年限的葛根木質部中葛根素的質量分數高于葛根韌皮部，分析其原因可能是葛根韌皮部外圍的木栓層在總質量中占有一定的比例，從而導致韌皮部中葛根素的質量分數偏低。因此，在葛根初加工時，將葛根表面的粗皮（木栓層）刮去，可提高葛根中葛根素的質量分數[10]。

綜上所述，該方法操作簡單、結果可靠，適用于葛根藥材的質量控制。由含量測定結果可知，葛根適宜的采收期應確定在第2～3年；葛根莖部中葛根素的含量較少，不宜入藥。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：312.

[2]劉圣，張小力，余娜，等.葛根素對早期糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化與BMP-7蛋白及mRNA表達的影響[J].中國藥房，2013，24（3）：196.

[3]劉計權，劉亞明，裴香萍，等.山西產葛根總黃酮及3種異黃酮含量的測定[J].中華中醫藥雜志，2012，27（2）：309.

[4]楊志勇.葛根醇提物對糖尿病模型大鼠血脂與血管的保護作用[J].中國藥房，2013，24（43）：4 063.

[5]唐洪梅，柴玉娜，涂星，等.丹參聯合葛根對糖尿病眼病模型大鼠的協同作用[J].中國藥房，2014，25（11）：977.

[6]李燕燕，邊寶林，楊健，等.葛根丹參膠囊成型工藝的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2008，14（4）：22.

[7]王金萍，曾明，邊佳明，等.葛根復方對創傷應激大鼠神經內分泌的調整作用[J].中國實驗方劑學雜志，2007，13（3）：50.

[8]陳麗紅，唐于平，王強.葛根芩連配方顆粒提取工藝研究[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（14）：4.

[9]郭巧生.藥用植物栽培學[M].北京：高等教育出版社，2004：45.

[10]王書林.藥用植物栽培技術[M].北京：中國中醫藥出版社，2006：443.