正交設計優選九味益胃合劑提取工藝研究

肖衛紅，楊全偉，何 偉，張 耕（武漢市第一醫院，武漢 430022）

九味益胃合劑為武漢市中西醫結合醫院國家級重點專科脾胃病科的臨床處方，是在四君子湯合左金丸基礎上化裁而來，主要功能為益氣和胃、活血止痛，用于脾胃虛弱、血瘀胃痛、體倦神疲、噯腐吞酸、纏綿反復。臨床上使用后可提高潰瘍愈合質量，與三聯療法合用可提高幽門螺桿菌根除率[1]。該方主要由丹參、太子參、赤芍、姜黃連、大黃等9味中藥組成，故命名為九味益胃合劑。為了優選其提取工藝，以最節省的成本來達到最優提取效果，使其更好地發揮臨床療效，筆者以方中君藥丹參中水溶性成分丹酚酸B的含量、赤芍中芍藥苷的含量和干膏提取率進行加權評分作為綜合考察指標，設計L9（34）正交試驗，確定九味益胃合劑的最優提取因素水平。試驗方法與結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A系列高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；e2695系列高效液相色譜儀（美國Waters公司）；ME215S電子天平（瑞士Sartorius公司，實際分度值d＝0.01 mg）。

1.2 藥品、藥材與試劑

丹酚酸B對照品（批號：110715-201016，純度：95.4%）、芍藥苷對照品（批號：110736-201037，純度：95.4%）均購于中國食品藥品檢定研究院；丹參、太子參、赤芍、當歸、姜黃連、仙鶴草、紅花、茯苓、炙甘草（湖北天濟中藥飲片有限公司，批號：20130402）；甲醇、乙腈為色譜純，水為雙重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 丹酚酸B的含量測定[2]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ODS Hypersil-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-水-甲酸（7∶25∶67∶1，V/V/V/V），流速：1.0 ml/min；紫外檢測器檢測波長：286 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μl。

2.1.2 溶液制備（1）丹酚酸B對照品溶液。精密稱取丹酚酸B對照品13.94 mg，置于50 ml量瓶中，加75%甲醇，制成每1 ml含0.278 8 mg的溶液即得。（2）供試品溶液。按比例稱取九味益胃合劑處方藥材，用10倍量的水浸泡1 h，水回流提取2次，每次提取1 h，收集所得藥液，濃縮至200 ml，搖勻；精密量取2 ml，置于50 ml量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液即得。（3）丹參陰性溶液。稱取不含丹參的其余藥材，按“（2）”項下供試品溶液制備方法制備即得。

2.1.3 方法專屬性試驗 吸取上述3種溶液各10μl，進樣檢測。結果，丹酚酸B對照品和供試品溶液均在18 min左右出現丹酚酸B色譜峰；供試品溶液色譜圖中丹酚酸B色譜峰峰形尖銳、對稱性好，與前后其他峰分離度均大于1.5；按丹酚酸B計，理論板數大于2 000，且陰性對照無干擾。色譜見圖1。

圖1 丹酚酸B高效液相色譜圖A.丹酚酸B對照品溶液；B.供試品溶液；C.丹參陰性溶液；1.丹酚酸BFig 1 HPLC chromatograms of salvianoli acid BA.control solution of salvianoli acid B；B.test solution；C.negative solution of Salvia miltiorrhiza；1.salvianoli acid B

2.1.4 線性關系考察 取丹酚酸B對照品溶液，精密取2、3、4、5、10 ml分別至20 ml量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。取上述稀釋后溶液及母液分別進樣10 μl，測定峰面積（y），以y與對照品質量濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程為y＝11 143x－23 229（r＝0.999 9）。結果表明，丹酚酸B檢測質量濃度線性范圍為27.88～278.80 μg/ml。

2.1.5 精密度試驗 精密取丹酚酸B對照品溶液10 ml置于20 ml量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻；連續進樣6次，計算峰面積的RSD＝1.02%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取供試品溶液分別于制備后0、1、2、4、8、12 h進樣測定峰面積，得峰面積的RSD＝0.49%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.1.7 重復性試驗 取同一批樣品，按供試品溶液的制備方法平行制備6份，測定丹酚酸B的含量。結果平均含量為1.966 4 mg/ml（RSD＝0.83%，n＝6），表明本法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品6份，制備成供試品溶液后精密量取1 ml，分別置于50 ml量瓶中，各精密加入適量的丹酚酸B對照品，加75%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液分別進樣、測定并計算回收率。結果平均回收率為97.54%（RSD＝1.85%，n＝6）。

2.2 芍藥苷的含量測定[2]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ODS Hypersil-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14 ∶86，V/V），流速：1.0 ml/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.2.2 溶液制備（1）芍藥苷對照品溶液。精密稱取芍藥苷對照品適量，加稀乙醇使溶解，制成每1 ml含0.616 mg的溶液即得。（2）供試品溶液[3]。按比例稱取九味益胃合劑處方藥材，用10倍量的水浸泡1 h，水回流提取2次，每次提取1 h，收集所得藥液，濃縮至200 ml，搖勻；精密取3 ml，置于25 ml量瓶中，加稀乙醇適量，超聲處理（功率：240 W，頻率：45 kHz）30 min后取出，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得。（3）赤芍陰性溶液。按處方比例稱取缺赤芍藥材，按“（2）”項下供試品溶液制備方法制備即得。

2.2.3 方法專屬性試驗 精密吸取上述3種溶液各10μl進樣檢測。結果，芍藥苷對照品溶液和供試品溶液均在9 min左右出現芍藥苷色譜峰；供試品溶液色譜圖中芍藥苷色譜峰峰形尖銳、對稱性好，與前后其他峰分離度均大于1.5；按芍藥苷計，理論板數大于2 000，且赤芍陰性溶液無干擾。色譜見圖2。

圖2 芍藥苷高效液相色譜圖A.芍藥苷對照品溶液；B.供試品溶液；C.赤芍陰性溶液；1.芍藥苷Fig 2 HPLC chromatograms of paeoniflorinA.control solution of paeoniflorin；B.test solution；C.negative solution of Paeonia Radix Rubra；1.paeoniflorin

2.2.4 線性關系考察 精密取已制備的各質量濃度的芍藥苷對照品溶液（24、36、48、60、180 μg/ml）分別進樣10 μl，測定峰面積（y），以y與對照品質量濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程為y＝24 014x+57 187（r＝0.999 3）。結果表明，芍藥苷檢測質量濃度線性范圍為24.64～172.48 μg/ml。

2.2.5 精密度試驗 精密取對照品溶液10 ml至20 ml量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻。連續進樣6次，記算芍藥苷峰面積RSD＝1.21%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取供試品溶液分別于制備后0、1、2、4、8、12 h時進樣10 μl，測定峰面積，計算得芍藥苷峰面積的RSD＝1.46%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批樣品，按供試品溶液的制備方法平行制備6份，測定芍藥苷的含量。結果其平均含量為0.310 mg/ml（RSD＝0.95%，n＝6），表明本法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品6份，制備成供試品溶液。精密量取1 ml，分別置于50 ml量瓶中，各精密加入適量的丹酚酸B對照品，加75%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液分別進樣、測定并計算回收率。結果平均回收率為100.27%（RSD＝1.04%，n＝6）。

2.3 正交試驗

[4-6]及預試驗基礎上，針對藥材的加水倍量、提取時間、浸泡時間、提取次數等4個影響因素，以丹酚酸B含量、芍藥苷含量為主要評價指標，設計L9（34）正交試驗；以干膏得率（干膏總質量/藥材總質量×100%）為次要指標，權重系數按丹酚酸B含量、芍藥苷含量、干膏得率分別為40、40、20來計算綜合評分，即綜合評分＝（丹酚酸B含量/丹酚酸B含量最大值）×100×40%+（芍藥苷含量/芍藥苷含量最大值）×100×40%+（干膏得率/干膏得率最大值）×100×20%。

稱取處方比例的藥材共9份，每份121.5 g，按表1因素與水平安排試驗，藥材加適量水浸泡、煎煮一定時間后合并提取液，過濾濃縮至200 ml，得藥液后檢測各項指標。因素與水平見表1；正交試驗結果見表2；方差分析結果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

通過綜合評分直觀分析，4個因素對丹酚酸B含量、芍藥苷含量、干膏得率的影響程度不同，因素C＞D＞A＞B，最優工藝為A3B1C2D3。根據方差分析結果可知，因素C、D對綜合評分均有顯著性影響，但由于提取2次與3次對試驗結果影響不大，結合生產實際，從節約成本方面綜合考慮后，最終確定最優工藝為A2B1C2D2，即加8倍量藥材水浸泡1 h，提取2次，每次1 h。根據最優工藝進行提取，3批樣品驗證試驗結果表明綜合評分的RSD＜2%（n＝3），表明提取工藝穩定，詳見表4。

3 討論

表4 驗證試驗結果Tab 4 Results of verification test

采用單一考察指標優選中藥提取工藝并不全面，因單一指標并不能完全代表中藥制劑整體質量的優劣[7]。丹參所含水溶性丹酚酸類成分在抗氧化、抗凝血、抗血栓形成、調血脂和細胞保護方面作用顯著[8-9]；而赤芍中的芍藥苷為其主要有效成分之一，具有活血化瘀、通脈、抗凝、抗炎、抗過敏藥效作用[10]，這與該處方的功能主治相一致。故以丹酚酸B與芍藥苷的含量作為丹參和赤芍提取效率的考察指標，比較符合中醫臨床用藥的習慣以及質量控制的要求。

本研究所建立的丹酚酸B和芍藥苷的高效液相色譜含量測定方法，經過全面的系統適用性試驗和方法學考察，具有分離度好、專屬性強、穩定性好、結果準確的特點，為正交試驗優選丹酚酸B、芍藥苷水回流提取工藝條件提供了可靠保障。本試驗所確定的九味益胃合劑的優選提取工藝，具有提取率較高、操作簡單、便于進行大生產的特點，且其批間質量穩定，故可作為九味益胃合劑的提取工藝方法。

參考文獻

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[9]王蓉，原永芳.丹酚酸B藥理作用的研究概況[J].中醫藥導報，2011，17（4）：130.

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