尼古丁乙醇脂質體的制備與體外透皮特性研究

王 慧，張曉紅，張 燕，楊苗苗，權 偉，戴尊孝（西安市精神衛生中心，西安 710061）

隨著吸煙人數與日俱增，死于與吸煙有關疾病的人數也隨之增加[1]。為此，世界衛生組織（WHO）提倡并于1996年向各國推薦了尼古丁替代法[2]。尼古丁替代法是采用非煙草的方式，向戒煙者提供小劑量安全性好的尼古丁制劑，使戒煙者尼古丁的攝取量達到最低，最終戒除香煙[3]。尼古丁是煙草的重要成分，研究表明，人體攝取尼古丁，反應性及注意力一定程度有所提高，焦慮明顯降低[4]。尼古丁易透過人體皮膚，但其本身性質不穩定，很大程度上限制了其在藥物研發中的應用。

乙醇脂質體憑借其良好的包封率及柔性，可攜帶藥物進入皮膚深層，是皮膚局部用藥較理想的載體[5]。為此，本實驗研制了尼古丁乙醇脂質體并通過體外透皮實驗研究其體外釋藥及透皮行為。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統（日本島津公司）；JEM-1200EX型透射電鏡（日本電子公司）；激光動態光散射儀（英國馬爾文儀器有限公司）；Tcs Sp2型激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡公司）；RYJ-6B型藥物透皮擴散試驗儀（上海黃海藥檢儀器廠）；RC-3B藥物溶出儀（天津大學無線電廠）；RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

尼古丁原料藥（重慶博騰制藥科技股份有限公司，批號：130211，純度：＞96%）；大豆磷脂（PC，常州四藥制藥有限公司，批號：1208S02，含量：90%）；羅丹明B（美國Sigma公司）；水為去離子雙蒸水。

1.3 動物

昆明種小鼠，♂，體質量為18～20 g，由蘭州大學動物實驗中心提供，合格證號為SCXK（甘）14-006。

透析袋（上海通善生物科技有限公司，截留分子質量：8 000～14 000）。

2 方法與結果

2.1 尼古丁乙醇脂質體的制備

采用注入法[6]制備尼古丁乙醇脂質體。精密稱取尼古丁原料藥0.3 mg、磷脂適量、乙醇4.5 ml，溶解，置于磁力攪拌器上，在密閉條件下邊攪拌邊緩慢注入5.5 ml磷酸鹽緩沖液（PBS），攪拌30 min（整個過程溫度保持在45～55 ℃范圍內）；超聲20 min后，冷卻至室溫，微孔濾過，即得尼古丁乙醇脂質體。其中尼古丁含量為3%。采用透射電鏡觀察所制尼古丁乙醇脂質體的外觀形態，結果顯示，尼古丁乙醇脂質體外觀為均一穩定的分散體系，大多數呈球形的雙分子層囊泡結構，詳見圖1。

圖1 尼古丁乙醇脂質體的電鏡照片（×110 000）Fig 1 SEM photograph of nicotine ethosome（×110 000）

2.2 尼古丁脂質體和尼古丁乙醇溶液的制備

采用反相蒸發法制備尼古丁含量為3%的尼古丁脂質體。將尼古丁原料藥溶于乙醇溶液中，制備尼古丁含量為3%的尼古丁乙醇溶液。

2.3 乙醇、磷脂用量對乙醇脂質體粒徑和包封率的影響

由預試驗可知，尼古丁乙醇脂質體受乙醇用量（占處方量的比例，V/V）和磷脂用量（占處方量的比例，m/V）的影響最大。本試驗采用單因素試驗考察0、25%、35%、45%乙醇和1%、2%、3%磷脂對尼古丁乙醇脂質體粒徑和包封率的影響，粒徑采用激光動態光散射儀測定，結果見表1。

表1 乙醇、磷脂用量對尼古丁乙醇脂質體粒徑和包封率的影響（）Tab 1 Effects of the amounts of ethanol and phospholipid on the particle size and encapsulation efficiency of the nicotine ethosome（）

表1 乙醇、磷脂用量對尼古丁乙醇脂質體粒徑和包封率的影響（）Tab 1 Effects of the amounts of ethanol and phospholipid on the particle size and encapsulation efficiency of the nicotine ethosome（）

由表1可見，與不含乙醇的處方10比較，加入乙醇的脂質體的粒徑明顯減小，包封率均增加。另外，固定乙醇濃度，增加磷脂含量，脂質體的粒徑逐漸增大，包封率也隨之增加；固定磷脂含量，增加乙醇濃度，脂質體的粒徑逐漸減小，包封率逐漸增加。研究表明，粒徑越小，包封率越大，脂質體越易攜帶藥物經皮滲透[7]。因此篩選乙醇脂質體的處方為乙醇用量為35%，磷脂用量為3%。

2.4 尼古丁的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：VP-ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.02 mol/L醋酸銨-三乙胺（30 ∶60 ∶0.1，V/V/V），流速：1 ml/min；檢測波長：365 nm；進樣量：20 μl。

2.4.2 標準曲線的制備 精密稱取尼古丁20 μg，置于50 ml量瓶，甲醇溶解，得質量濃度為400 μg/L的對照品溶液。用甲醇稀釋適量對照品溶液，制備成質量濃度分別為6.25、12.5、25、50、75、100、200、400 μg/L的系列溶液，按“2.4.1”項下方法進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線回歸方程為y＝87 345x+35 671（r＝0.999 8）。結果表明，尼古丁檢測質量濃度的線性范圍為6.25～400 μg/L。

2.4.3 精密度試驗 精密量取適量尼古丁對照品溶液，用甲醇稀釋制備成低、中、高3種質量濃度（6.25、50、200 μg/L）的溶液，分別于同日內不同時間進樣測定5次，考察日內精密度；另每日測定1次，連續測定3 d，考察日間精密度。結果顯示，平均日內RSD為2.03%（n＝5），平均日間RSD為2.18%（n＝3），表明該方法精密度良好。

2.4.4 回收率試驗 將空白乙醇脂質體置于5 ml量瓶，加入用甲醇稀釋的6.25、50、200 μg/L尼古丁溶液，渦旋混合器上充分振蕩混勻。取1 ml置于離心管中，10 000 r/min（離心半徑為6 cm）離心5 min，吸取上清液，微孔濾膜濾過，取20 μl進樣測定峰面積。計算平均回收率為99.70%，RSD為0.91%，表明該方法回收率良好。

2.5 尼古丁乙醇脂質體包封率測定

精密量取尼古丁乙醇脂質體4 ml，溶解于10 ml乙醇中，搖勻，微孔濾膜濾過，取20 μl進樣測定，計算尼古丁總含量（H1）。再精密量取尼古丁乙醇脂質體4 ml，置于透析袋中，扎緊透析袋兩頭，放入100 ml含乙醇35%的PBS中，攪拌，達到平衡時間（6 h），量取透析液，微孔濾膜濾過，取20 μl進樣測定峰面積，計算游離尼古丁含量（H2）。按公式計算尼古丁乙醇脂質體的包封率（EE，%）＝（H1－H2）/H1×100%。

按“2.3”項下篩選的處方（磷脂、乙醇及尼古丁分別占處方量的3%、35%和3%）所制尼古丁乙醇脂質體的包封率為（89.13±6.12）%，RSD＝0.28%（n＝3）。

2.6 尼古丁乙醇脂質體的體外釋放

取尼古丁乙醇脂質體、尼古丁脂質體及尼古丁乙醇溶液各3 ml，均含尼古丁90 mg，分別加至預處理好的透析袋中，扎緊兩端袋口，固定于槳上[8]。釋放條件：pH 7.4的PBS 500 ml，37 ℃，100 r/min。分別于0、3、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h時取樣2 ml，同時補充等量同溫的PBS。取樣液經微孔濾膜濾過，取20 μl進樣測定峰面積，計算累積釋放量，重復測定3次。3種制劑中尼古丁的累積釋放曲線見圖2。

由圖2可知，在釋放6 h時，尼古丁乙醇脂質體累積釋放量為40%，而尼古丁脂質體釋放量為62%，尼古丁乙醇溶液已達90%；經過24 h，尼古丁乙醇脂質體和尼古丁脂質體中的尼古丁基本達到完全釋放。由此可見，尼古丁乙醇脂質體具有明顯的緩釋作用。

2.7 離體皮膚滲透試驗

2.7.1 離體小鼠皮膚的制備 取健康小鼠，飼養1周，剪去背部毛，斷頸處死，立即剝離背部皮膚，去除皮下組織，生理鹽水沖洗、浸泡，貯藏于4 ℃冰箱中備用。

圖2 3種制劑中尼古丁的累積釋放曲線（n＝3）Fig 2 Cumulative release curve of nicotine in 3 kinds of preparation（n＝3）

2.7.2 體外經皮滲透試驗[9]本試驗在Franz擴散池中進行，供給室和接收室之間固定離體皮膚，有效滲透面積（擴散池）為2.5 cm2，接收液為pH 7.4的PBS，接收室體積為6 ml。分別取尼古丁乙醇脂質體、尼古丁脂質體和尼古丁乙醇溶液各0.3 ml，滴于與接收液接觸的離體皮膚上，并將接收池置于（36±2）℃恒溫水浴中，電磁攪拌（350 r/min）。分別于0、0.5、1、2、3、6、8、12、24 h精密量取2 ml接收液，同時補充等量恒溫的接收液。取樣液經微孔濾膜濾過，取20 μl進樣測定含量，計算累積滲透量。重復測定3次。3種制劑中尼古丁的累積滲透曲線見圖3。

圖3 3種制劑中尼古丁的累積滲透曲線（n＝3）Fig 3 Cumulative penetrating curve of nicotine in 3 kinds of preparation（n＝3）

由圖3可知，12 h時尼古丁乙醇脂質體的累積滲透量最高（45%），尼古丁脂質體的累積滲透量最低（15%），但12 h時3種制劑的累積滲透量均達飽和。

2.8 滲透深度檢測[10]

將含有0.03%羅丹明B的熒光劑分別加入尼古丁脂質體、尼古丁乙醇溶液和尼古丁乙醇脂質體中。將以上3種含有熒光劑的制劑及尼古丁乙醇脂質體分別均勻涂抹于同一只小鼠背部皮膚上，涂藥面積約2 cm2。給藥后12 h處死小鼠，取皮，立即用生理鹽水沖洗涂藥區域，剪取涂藥中心區域約1 mm2，用共聚焦激光掃描顯微鏡對離體皮膚斷層進行掃描并繪制曲線。4種制劑的共聚焦激光掃描圖見圖4，熒光強度-皮膚深度曲線見圖5。

由圖4、圖5可見，尼古丁乙醇脂質體、尼古丁乙醇溶液及尼古丁脂質體在離體皮膚中最大熒光強度分別為168、75、36 AU，滲透深度分別為175、156、80 μm，而尼古丁乙醇脂質體（對照）幾乎無熒光。表明與乙醇溶液和脂質體比較，乙醇脂質體可攜帶尼古丁進入皮膚深層。

圖4 4種制劑的共聚焦激光掃描圖A.含羅丹明B的尼古丁脂質體；B.含羅丹明B的尼古丁乙醇溶液；C.含羅丹明B的尼古丁乙醇脂質體；D.尼古丁乙醇脂質體Fig 4 Confocal laser scanning micrograms of 4 kinds of preparationsA.rhodamine B-containing nicotine ethosome；B.rhodamine B-containing nicotine/ethanol solution；C.rhodamine B-containing nicotine ethosome；D.nicotine ethosome

圖5 4種制劑的熒光強度-皮膚深度曲線（n＝5）Fig 5 Curves of fluorescence intensity-penetration depth in skin of 4 kinds of preparations（n＝5）

2.9 穩定性試驗

將尼古丁乙醇脂質體封裝于錐形瓶中，放于冰箱（4 ℃）及室溫下，每個月用動態光散射法測量樣品的粒徑及粒徑分布，同時電鏡觀察乙醇脂質體結構，連續測定3個月。結果表明本品穩定性良好。

3 討論

注入法制備的尼古丁乙醇脂質體形狀均勻，平均粒徑為105 nm。當磷脂與乙醇占處方量的3%和35%時為最佳處方，此時所制脂質體包封率最高（89.13±6.12）%，且室溫及冰箱（4 ℃）放置3個月穩定性良好。體外釋放實驗表明，乙醇脂質體有明顯的緩釋作用。體外經皮滲透實驗表明，乙醇脂質體透過離體皮膚進入PBS中的藥量分別是乙醇溶液及脂質體的1.45倍和2.8倍。共聚焦激光掃描顯微電鏡試驗表明，與乙醇溶液及脂質體相比，乙醇脂質體可攜帶藥物進入皮膚深層，同時增大藥物在皮內的滯留量。因而，尼古丁乙醇脂質體有望開發成為戒煙的有效制劑。

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