超級細菌NDM-1質粒的水平轉移研究

劉果，孫洋，紀雪，佟盼盼，祝令偉，劉軍，周偉，郭學軍，馮書章

(軍事醫學科學院軍事獸醫研究所/吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春130122)

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超級細菌NDM-1質粒的水平轉移研究

劉果，孫洋*，紀雪，佟盼盼，祝令偉，劉軍，周偉，郭學軍，馮書章*

(軍事醫學科學院軍事獸醫研究所/吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春130122)

為探究超級細菌NDM-1質粒水平傳播的特性，以攜帶NDM-1質粒的貓源洛菲不動桿菌和人源醋酸鈣不動桿菌為供體菌，以工程菌株大腸桿菌DH5α和大腸桿菌、沙門氏菌弱毒菌株為受體菌，通過接合試驗驗證了NDM-1基因通過質粒跨種傳播的可能性。結果顯示，貓源NDM-1質粒可以轉入E.coliDH5α中，并可以DH5α為中介，轉入豬霍亂沙門氏菌C500中；而人源NDM-1質粒僅轉入E.coliDH5α中，未能轉入其他菌株。NDM-1質粒在沙門氏菌C500中比在E.coliDH5α中較為穩定遺傳。質粒的導入并不影響宿主菌的生長特性。本研究初步揭示了NDM-1的傳播方式，表明NDM-1質粒能夠跨越菌種界限，并可以大腸桿菌為中介，轉移至其它菌株中。

新德里β內酰胺酶-1；接合轉移；水平傳播

新德里β內酰胺酶-1(New Delhi Metallo-betalactamase-1,NDM-1)自2008年首次被發現以來，就在腸桿菌科細菌中迅速蔓延，成為一個全球性的公共衛生學問題[1]。鑒于寵物多與人密切接觸以及NDM-1跨種傳播的可能性，寵物體內出現NDM-1，更是引起了人們的擔憂[2]。為了探究NDM-1質粒的水平轉移特性，本研究以攜帶NDM-1質粒的貓源洛菲不動桿菌Iz4b和人源醋酸鈣不動桿菌XM1570為供體菌，通過接合試驗驗證NDM-1質粒跨種傳播的可能性，并對接合子特性進行研究，以期為預防和控制NDM-1的傳播提供科學數據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供體菌：貓源洛菲不動桿菌Iz4b，人源醋酸鈣不動桿菌XM1570。受體菌：大腸桿菌DH5α，致病性大腸桿菌EPEC E2348/69，出血性大腸桿菌O157 F25，鼠傷寒沙門氏菌SMT，豬霍亂沙門氏菌C500。以上菌株均由本實驗室保存。

1.1.2 質粒 pBR322：攜帶氨芐西林(AMP)、四環素(TET)抗性；pBR325：攜帶氨芐西林、四環素和氯霉素(CHL)抗性；由本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 亞胺培南(IPM)為Merck公司產品；氯霉素和四環素為Sigma公司產品；胰蛋白胨，酵母提取物為英國Oxoid公司產品。

1.1.4 主要儀器 生物安全柜(1300A2)購自美國Thermo公司；BD PhoenixTM-100 System細菌鑒定儀、Phoenix SpecTM比濁儀均購自美國BD公司；紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 根據文獻[3]合成引物，PCR鑒定上述兩株供體菌的NDM-1基因。通過BD PhoenixTM-100 System全自動微生物鑒定/藥敏系統對供體菌和受體菌進行生化及藥敏檢測。

1.2.2 受體菌篩選標記 通過電轉化，向E.coliDH5α導入質粒pBR322，向其它受體菌株導入質粒pBR325，使其具有TET及CHL的抗性便于后續接合子的篩選。轉化子分別標記為DH5α::pBR322、 E2348/69::pBR325、F25::pBR325、SMT::pBR325和 C500::pBR325。按照CLSI(2012版)推薦的微量肉湯稀釋法，測定各轉化子對TET及CHL的MIC。

1.2.3 接合試驗 采用濾膜接合法，并根據文獻[4-5],優化實驗條件，如延長接合時間，提高供體菌和受體菌濃度，用亞抑菌濃度抗生素促進，用納米材料促進等，多次進行接合試驗。

濾膜接合法：將供、受體菌分別于相應抗性LB培養基中(供體菌為8 μg/mL IPM；受體菌：DH5α::pBR322為128 μg/mL TET，E2348/69::pBR325、F25::pBR325、SMT::pBR325、和C500::pBR325為100 μg/mL CHL)過夜培養，分別取1 mL供體菌和1 mL受體菌于1.5 mL離心管中，8000 r/min離心2 min，棄上清，用1 mL生理鹽水清洗三次。向供體菌和受體菌分別加100 μL生理鹽水重懸，然后將供體菌和受體菌混合，震蕩混勻。取煮沸滅菌后的濾膜放在LB瓊脂培養基上，滴加100 μL混合菌液于濾膜上。37 ℃恒溫培養4 h后，用1 mL生理鹽水沖洗濾膜，收集沖洗后的菌液，生理鹽水100倍稀釋后，取100 μL涂于相應的雙抗LB平板(DH5α::pBR322作為受體菌時，雙抗濃度為8 μg/mL IPM，128 μg/mL TET；其他菌株為受體菌時，雙抗濃度為8 μg/mL IPM，100 μg/mL CHL)。37 ℃恒溫培養16～20 h，雙抗平板上生長的單菌落判定為疑似接合子。

1.2.4 接合子鑒定 挑取雙抗平板上生長的單菌落培養，根據文獻[6-7]合成大腸桿菌和沙門氏菌特異性引物，PCR驗證疑似接合子。對PCR呈NDM-1陽性的菌株，使用大腸桿菌或沙門氏菌的特異性引物PCR驗證菌株是否為接合子。對于驗證陽性的接合子，通過BD PhoenixTM-100 System全自動微生物鑒定/藥敏系統進行生化和藥敏鑒定。

1.2.5 最小抑菌濃度(MIC)試驗 按照CLSI推薦的微量肉湯稀釋法，測定供受體菌及接合子對IPM的MIC。

1.2.6 NDM-1質粒遺傳穩定性實驗 將供體菌及接合子劃線于IPM(16 μg/mL)抗性平板上，挑取單菌落于抗性液體LB培養基中，37 ℃培養12 h，取5 μL菌液于5 mL新鮮無抗LB液體培養基中，過夜培養后，稀釋涂布于無抗LB瓊脂平板上，長出單菌落后，挑取230個左右單菌落，點種于IPM(16 μg/mL)抗性LB平板，在抗性平板上不生長的菌落即為質粒丟失的菌株。質粒的丟失率=不生長的菌落數/挑取的菌落總數。

1.2.7 接合子生長特性 從抗性平板上挑取受體菌DH5α::pBR322、C500、C500::pBR325以及所獲得的接合子的單菌落，于5 mL抗性液體培養基中，37 ℃恒溫搖床中培養過夜。取1 mL菌液于100 mL 新鮮LB培養基中，充分振蕩，混合均勻， 37 ℃恒溫180 r/min振蕩培養，用紫外可見分光光度計于波長600 nm處測定菌液吸光度，每小時測定一次。觀察NDM-1質粒對于宿主菌生長特性的影響。

2 結果與分析

2.1 供受體菌鑒定 經PCR鑒定，供體菌Iz4b和XM1570均攜帶NDM-1耐藥基因。細菌鑒定及藥敏檢測結果表明，Iz4b對所測的β-內酰胺類、磺胺類、喹諾酮類抗生素均耐藥，對IPM的MIC為512 μg/mL，對阿米卡星敏感；XM1570對所測的β-內酰胺類抗生素耐藥，對IPM的MIC為256 μg/mL，對其他抗生素均敏感。受體菌對所測抗生素均敏感。供體菌及部分受體菌藥敏檢測結果見表1。

表1 供體菌和部分受體菌藥敏檢測結果表

注：R：耐藥；I：中介；S：敏感。MIC：細菌鑒定儀藥敏檢測結果。*MIC：參照CLSI，用微量肉湯稀釋法測定的MIC值

2.2 質粒電轉化 pBR322轉入DH5α后，DH5α::pBR322對TET的MIC提高至256 μg/mL；pBR325轉入大腸桿菌弱毒株E2348/69、F25，以及沙門氏菌疫苗株SMT、C500后，轉化子對CHL的MIC提高至512 μg/mL。

2.3 接合試驗 在濾膜接合法實驗中，將NDM-1質粒從洛菲不動桿菌Iz4b中轉移至DH5α::pBR322中，命名為DH5α::pBR322-NDM-1。DH5α::pBR322-NDM-1容易丟失質粒而變得對IPM敏感，在抗性條件下連續傳代，獲得了一個穩定菌株，命名為DH5α::pBR322-NDM-1-1。將NDM-1質粒從醋酸鈣不動桿菌XM1570中轉入DH5α::pBR322中，命名為DH5α::pBR322-NDM-1-2。而其余四個弱毒受體菌均未能直接通過接合試驗獲得兩供體菌的NDM-1質粒。以DH5α::pBR322-NDM-1-1及DH5α::pBR322-NDM-1-2為供體菌，繼續向其他受體菌中接合轉移，NDM-1質粒從DH5α::pBR322-NDM-1-1轉移至豬霍亂沙門氏菌C500::pBR325中，接合子命名為C500::pBR325-NDM-1。

2.4 接合子鑒定 接合子DH5α::pBR322-NDM-1、DH5α::pBR322-NDM-1-1、DH5α::pBR322-NDM-1-2和C500::pBR325-NDM-1通過NDM-1基因引物和特異性引物PCR驗證均為陽性。藥敏檢測結果表明，除DH5α::pBR322-NDM-1外，其他接合子均獲得了β-內酰胺類耐藥表型，對IPM的MIC提高至128 μg/mL以上，具體結果見表2，結果表明NDM-1質粒可以從不動桿菌跨種傳播到大腸桿菌和沙門氏菌中。

表2 接合子藥敏檢測結果表

注：R：耐藥；I：中介；S：敏感。MIC：細菌鑒定儀藥敏檢測結果。*MIC：參照CLSI，用微量肉湯稀釋法測定的MIC值。

2.5 NDM-1質粒的遺傳穩定性 在無抗性LB液體中培養12 h，供體菌及接合子的質粒丟失率如表3。結果表明，NDM-1質粒在原宿主菌中能穩定存在。Iz4b中NDM-1質粒在新的宿主菌DH5α::pBR322中極不穩定，接合子在無抗LB液體中培養12 h后，質粒幾乎完全丟失。而抗性條件下傳代獲得的菌株，質粒會相對穩定的存在，但丟失率超過50%，轉入C500后，質粒穩定性增加。XM1570中NDM-1質粒在DH5α中易丟失，12 h培養，丟失率達80.6%。

表3 NDM-1質粒丟失率表

2.6 接合子的生長特性 DH5α::pBR322、DH5α::pBR322-NDM-1-1和DH5α::pBR322-NDM-1-2及C500、C500::pBR325和C500::pBR325-NDM-1的生長曲線如圖1所示。由圖中可知，原受體菌與接合子生長曲線無顯著差異，因此NDM-1質粒并不影響宿主菌的生長特性。

3 討論與小結

圖1 受體菌及接合子生長曲線(A. DH5α::pBR322及接合子生長曲線；B. C500，C500::pBR325及接合子生長曲線)

超級細菌攜帶NDM-1質粒，可耐受幾乎所有的抗生素，因而具有重要的公共衛生意義。目前，NDM-1在世界各地腸桿菌科的大部分細菌中，包括肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等均被發現，我國被認為是繼印度和巴基斯坦之后的NDM-1多發國之一[8]。在我國檢測到的多種攜帶NDM-1的腸桿菌菌株大多為散發，這標志著NDM-1的傳播主要由接合性質粒及其攜帶的可移動元件介導，這與其它國家監測到的NDM-1的傳播特點相一致[9]。目前對NDM-1傳播方式的探究多為基于流行病學調查結果所做的推斷，迫切需要研究來驗證和揭示NDM-1傳播的特點及其潛在傳播機制。

細菌耐藥性傳播的重要方式之一是接合(conjugation)，耐藥性質粒作為可移動遺傳元件通過細菌表面的性纖毛從一個細菌轉移到另一個細菌，并使受體菌獲得相應的耐藥表型。大量文獻[9-11]表明，NDM-1質粒可以通過接合的方式轉移至工程菌株E.coliJ53及DH5α中，但國內外尚未見到向其他弱毒及野生菌株轉移的報道。Iz4b是本實驗室于2012年從病犬體內分離得到的一株亞胺培南耐藥的洛菲不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)，其攜帶的NDM-1位于質粒上，我們將該質粒命名為pNDM-Iz4b。全質粒測序結果表明：該質粒全長46570 bp，其大部分序列與人源醋酸鈣不動桿菌XM1570[10]中NDM-1質粒pXM1一致，僅在接合轉移相關的區域(traC)有705 bp的缺失，此705 bp包含一個調節核酸酶活性相關蛋白的編碼基因和206 bp的正向重復序列。兩質粒均含有traA、traC和traD三個與接合轉移有關的基因，且在NDM-1上下游有ISAba125，構成了Tn125轉座子。說明NDM-1耐藥基因可能通過轉座以及細菌之間的接合等方式傳播，而跨種傳播到其他細菌中。

Iz4b和XM1570作為供體菌時，只有工程菌株DH5α獲得了NDM-1質粒，說明工程菌株相對于其它菌株更容易接受外源大質粒。貓源Iz4b的NDM-1質粒在DH5α宿主中不能穩定遺傳，這與Chen[11]等的報道一致。抗性條件下傳代后能獲得相對穩定的菌株，說明抗性條件有利于細菌耐藥基因的穩定存在。以穩定的DH5α接合子為中介，pNDM-Iz4b可接合轉移至豬霍亂沙門氏菌C500中，而pXM1未能轉移，可能與兩質粒序列差異有關。黃瑞等[12]曾用接合試驗驗證了傷寒桿菌耐藥質粒pRST98能在4種腸道桿菌間傳遞，同時能以大腸桿菌為媒介，將耐藥基因轉移給其他腸道菌。因此腸道中數量龐大的大腸桿菌可以作為耐藥基因的儲存庫和中轉站，將耐藥基因從非致病菌轉移至致病菌，這將會給人類健康構成嚴重的威脅。

本研究揭示了NDM-1質粒可以通過接合方式傳播其耐藥性，在研究NDM-1質粒這種轉移方式時，發現了有趣而重要的現象，這就是：①NDM-1質粒可以跨種傳播，從不動桿菌轉移到大腸桿菌和沙門氏菌；②NDM-1質粒的遺傳穩定性依受體菌種類不同而有所差異，在所實驗的大腸桿菌和沙門氏菌中，NDM-1質粒在沙門氏菌中能夠較為穩定的遺傳；③NDM-1質粒的跨種傳播受受體菌遺傳背景的影響，受體菌所攜帶的自然質粒(尤其是不相容性質粒)可能在一定程度上影響著NDM-1質粒接合性轉移或轉化效率和傳播速度。此研究結果對于深入探究超級細菌的形成及其耐藥性的傳播具有重要意義。

近年來，NDM-1在中國的流行有加重的趨勢，流行病學調查結果顯示，克隆株傳播造成的暴發[13-14]和由接合性質粒及其攜帶的可移動遺傳元件(如ISAba125,Tn125等)介導的跨種傳播[9,11,15]，是導致NDM-1流行的主要原因。鑒于NDM-1能夠突破菌屬和地理界限而傳播，世界各國均應加強NDM-1的監測，深入探討其跨種傳播的可能方式，研究針對這類超級細菌的控制技術。

[1] Patel G, Bonomo R A. “Stormy waters ahead”: global emergence of carbapenemases [J]. Front Microbiol, 2013,4(48):doi: 10.3389/fmicb.2013.00048.

[2] AbrahamS, WongHS, Turnidge J,etal.Carbapenemase-producing bacteria in companion animals:apublichealth concern on the horizon [J].J AntimicrobChemother,2014,69(5):1155-1157.

[3] 陳碩. NDM-1鮑曼不動桿菌生物學特性分析[D].吉林: 吉林農業大學動物科學技術學院, 2012.

[4] 張鵬翼. 雙選擇抗生素影響大腸桿菌間質粒接合轉移的分子機制暨纖維堆囊菌So0157-2表達蛋白質組學分析[D]. 山東：山東大學, 2010.

[5] Qiu Z, Yu Y, Chen Z,etal. Nanoalumina promotes the horizontal transfer of multiresistance genes mediated by plasmids across genera[J].Proc Natl AcadSci U S A, 2012,109(13):4944-4949.

[6] Shahi S K, Singh V K, Kumar A,etal. Detection ofEscherichiacoliand associated β-lactamases genes from diabetic foot ulcers by multiplex PCR and molecular modeling and docking of SHV-1, TEM-1, and OXA-1 β-lactamases with clindamycin and piperacillin-tazobactam [J]. PLoS One, 2013, 8(7):e68234.

[7] 吳曉東,江潔,何煜波, 等.沙門氏菌PCR檢測方法的建立及其在蔬菜檢測中的應用[J]. 食品工業科技,2014,15:320-323.

[8] Berrazeg M, Diene S, Medjahed L,etal. New DelhiMetallo-beta-lactamase around the world: an eReview using Google Maps [J]. Euro Surveill, 2014, 19(20)pii: 20809.

[9] Wang X, Chen G, Wu X,etal. Increased prevalence of carbapenem resistantEnterobacteriaceaein hospital setting due to cross-species transmission of theblaNDM-1 element and clonal spread of progenitor resistant strains [J].Front Microbiol,2015, 6:595. doi: 10.3389/fmicb.2015.00595.

[10]Sun Y, Liu Q, Chen S,etal. Characterization and plasmid elimination of NDM-1-producingAcinetobactercalcoaceticusfrom China [J]. PLoS One. 2014, 9(9):e106555

[11]Chen Y, Zhou Z, Jiang Y,etal. Emergence of NDM-1-producingAcinetobacterbaumanniiin China [J]. J AntimicrobChemother, 2011, 66(6):1255-1259.

[12]黃瑞, 秦愛蘭, 聞玉梅.耐藥質粒pRST98在不同種屬腸道桿菌間的接合及表達[J].中華微生物學和免疫學雜志, 2000,20(4):323-326.

[13]Qin S, Fu Y, Zhang Q,etal.High Incidence and Endemic Spread of NDM-1-PositiveEnterobacteriaceaein Henan Province, China [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(8):4275-4282.

[14]Zhang X, Li X, Wang M,etal. Outbreak of NDM-1-ProducingKlebsiellapneumoniaeCausing Neonatal Infection in a Teaching Hospital in Mainland China [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59 (7): 4349-4351.

[15]Yang Q,Fang L, Fu Y,etal. Dissemination of NDM-1-Producing Enterobacteriaceae Mediated by the IncX3-Type Plasmid [J].PLoS One, 2015, 10(6):e0129454.

(編輯：侯向輝)

Horizontal Transferability of NDM-1 Plasmid

LIU Guo,SUN Yang*, JI Xue,TONG Pan-pan, ZHU Ling-wei, LIU Jun, ZHOU Wei, GUO Xue-jun,FENG Shu-zhang*

(InstituteofMilitaryVeterinary,AMMS/KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun130122,China)

The purpose of this study was to explore the horizontal transmission properties of NDM-1 plasmids in superbugs.Acinetobacterlwoffiiof cat origin andAcinetobactercalcoaceticusof human origin were used as donor strains,Escherichiacolistrain DH5α and four attenuated strains(twoE.colistrains and twoSalmonellastrains)were used as recipient strains, and conjugation experiment was conducted to explore the cross-species transferability of NDM-1 mediated by plasmids. The results showed NDM-1 plasmid of cat origin was able to transfer into DH5α, and then toSalmonellacholeraesuis C500 strain mediated by DH5α. NDM-1 plasmid of human origin was able to transfer to DH5α, but failed to transfer to other strains. Furthermore, NDM-1 plasmids in C500 could be more stably inherited than inE.coliDH5α. The plasmid transferred didn’t influence the growth properties of the host strains. This study indicated that NDM-1 plasmids were able to cross the genetic boundaries and transfer to other strains mediated byE.coli,which may shed some light on the horizontal transmission of NDM-1.

NDM-1;conjugation;horizontal transfer

科技部傳染病防治重大專項(2013ZX10004217)；863項目(2012AA022006)；吉林省科技計劃項目(20140101032JC，20150101110JC)

劉果，碩士研究生，從事細菌耐藥性研究。

馮書章,E-mail: shuzhangfeng@qq.com；孫洋,E-mail：sunyang10@hotmail.com

2015-07-17

A

1002-1280 (2015) 10-0015-07

S852.61