基于UPLC-MS/MS同時測定豬糞便中5種獸藥殘留量的研究

顧欣，張鑫，嚴鳳，吳劍平，李丹妮

(上海市獸藥飼料檢測所，上海201103)

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基于UPLC-MS/MS同時測定豬糞便中5種獸藥殘留量的研究

顧欣，張鑫，嚴鳳，吳劍平，李丹妮

(上海市獸藥飼料檢測所，上海201103)

為了建立同時測定豬糞便中二甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶、恩諾沙星、金霉素、泰樂菌素5種獸藥殘留量的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析方法，樣品經McIlvaine-Na2EDTA緩沖溶液提取，C18粉吸附雜質，HLB固相萃取小柱凈化，濃縮富集后用0.1%甲酸甲醇溶液復溶，過濾上機，基質液外標法定量。結果顯示，5種獸藥在10～500 μg/kg的質量濃度范圍內線性良好，在添加濃度50～500 μg/kg，平均回收率為53%～85%，RSD為1.87%～18.81%。該方法具有較好的準確度與精密度，能快速、準確測定豬糞便中5種獸藥殘留，為養殖環節實時監測獸藥使用情況提供了技術支持。

超高效液相色譜-串聯質譜；獸藥殘留；豬糞便

目前，國內獸藥殘留量的監測方法多針對動物組織，并不適用于養殖環節的活體監測。由于抗生素藥物進入動物消化道后，約60%～90%以原形或以代謝物形式經畜禽糞便排泄，為了研究和控制生豬養殖環節中的獸藥殘留，豬糞做為一種易獲得的活體檢材具有較高的研究價值，可以實時監測獸藥使用情況。因此，有必要建立一種簡便、準確的糞便中的獸藥殘留分析方法。

目前，文獻報道的糞便中獸藥殘留的分析方法多局限于某一類獸藥[4-5]，而糞便中多類藥物殘留的研究較少，對養殖場糞便樣品中的藥物檢測缺少相關依據。為了加強對養殖場用藥情況的監管，本文建立了利用固相萃取及超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)技術同時測定豬糞便中磺胺類、喹諾酮類、四環素類、大環內酯類四類常用獸藥，包括二甲氧芐啶(Diaveridine)、磺胺對甲氧嘧啶(Sulfameter)、恩諾沙星(Enrofloxacin)、金霉素(Chlorotetracycline)、泰樂菌素(Tylosin)5種常用獸藥殘留的分析方法，該法可操作性強，準確度與精密度較高，為養殖環節實時監測獸藥使用情況提供了檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-串聯質譜儀(WatersXevoTMTQ MS，ESI+)；電子天平；高速冷凍離心機；漩渦混勻器；超聲波清洗器；Waters OasisHLB固相萃取柱(3 mL/40 mg)；固相萃取裝置；氮吹儀；0.22 μm針式濾器(水相)。二甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶、恩諾沙星、金霉素、泰樂菌素對照品(美國Sigma；純度分別為99%、99%、99.8%、92%、98%)，甲酸、甲醇、乙腈(色譜純)；氨水、醋酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸鈉、檸檬酸(分析純)；高純氮；高純氬；親水性C18粉；實驗用水均為一級水。

1.2 溶液配置 標準儲備液：分別精密稱取5種獸藥標準品，用適量甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度各為1 mg/mL的標準儲備液，置于4℃冷藏保存，有效期6個月；樣品提取液：Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液，用NaOH溶液調節pH4.0，現配現用；定容液：0.1%甲酸甲醇水溶液(85/15，V/V)，準確量取15mL甲醇，加入85mL0.1%甲酸水溶液，充分混合即得。

1.3 前處理方法 將采集的新鮮糞便樣品，充分攪勻，放置在-18℃冰箱冷凍。稱取未完全解凍的豬糞便樣品1g(精確至0.01g)于50mL離心管中，準確加入C18粉0.5g及McIlvaine-EDTA緩沖液10mL，充分振蕩10min，4℃下10000r/min離心10min，移出上清液。重復上述操作，合并兩次上清液，備用。

HLB固相萃取小柱(3mL/40mg)用3mL甲醇，3mL水活化。取備用液4mL過柱，依次用 3mL5%甲醇溶液淋洗，3mL甲醇洗脫。收集洗脫液于40 ℃水浴下用氮氣吹至近干，用1.0mL0.1%甲酸甲醇水溶液(85/15，V/V)溶解殘渣，溶液過0.22μm濾膜后上機測定。

1.4 基質匹配標準品的配置 稱取五份空白豬糞便樣品各1g(精確至0.01g)，按照1.3項下提取、凈化、氮氣吹干后，分別加入1μg/mL的5種獸藥標準品混合工作液10、25、50、100、500μL，再用0.1%甲酸甲醇水溶液(85/15，V/V)定容至1mL，渦旋充分溶解殘渣，配制成質量濃度范圍為10、25、50、100、500μg/kg的基質匹配標準品，供液相色譜—串聯質譜儀測定。

1.5 儀器條件

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱：AgilentSBC181.8μm2.1mm×100mm；柱溫：35 ℃；進樣量：10μL；流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液；流速：0.3mL/min，優化的色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5.2 質譜條件 離子源：電噴霧正離子源；電離模式：正離模式(ESI+)；檢測方式：多反應檢測(MRM)；電離電壓：3.5 kV；錐孔溫度：500 ℃；脫溶劑氣流：800 L/Hr；反吹氣(氮氣)：50 L/Hr；定性離子對、定量離子對及對應錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 5種獸藥的定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量

2 結果

2.1 標準曲線 按照1.4操作步驟，配制成質量濃度為10、25、50、100、500 μg/kg的基質匹配標準品，供液相色譜-串聯質譜儀測定。以質量濃度C為橫坐標，以定量離子對相應的色譜峰面積A為縱坐標，繪制5種獸藥的基質匹配標準曲線。結果表明：5種藥物在10～500 μg/kg質量濃度范圍線性良好，線性實驗結果見表3。5種獸藥基質匹配標準品的MRM色譜圖見圖1。

表3 5種獸藥的基質添加標準曲線線性方程及相關系數

2.2 準確度與精密度 選取空白糞便樣品，準確加入一定質量濃度的5種獸藥混合標準品，進行添加回收實驗以考察方法的準確度與精密度。在空白糞便中5種獸藥各添加高、中、低三個含量水平。添加樣品按確定的步驟(1.3)處理并測定，批內相同的質量濃度水平做6次平行實驗，重復三個批次。測定結果見表4。

結果表明，豬糞中二甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶在三個含量水平下的回收率為72.16%～83.52%，恩諾沙星在三個含量水平下的回收率為66.80%～82.08%，金霉素、泰樂菌素在三個含量水平下的回收率為53.04%～84.08%。批內相對標準偏差(RSD，n=6)均在4.18%～18.81%之間，批間相對標準偏差(RSD，n=3)均在1.87%～17.27%之間。結果表明該方法具有較為良好的準確度和精密度。

表4 豬糞便中5種獸藥批內、批間回收率及相對標準偏差

圖1 5種獸藥基質匹配標準品的MRM色譜圖

2.3 實際樣品檢測 隨機抽取某養殖場的6個糞便樣品，采用建立的檢測方法進行測定，每份樣品做2次平行測定，結果取平均值，檢測結果匯總見表5。檢測結果顯示：金霉素、泰樂菌素、恩諾沙星在實際豬糞便樣品中的檢出率分別達到100%、33.3%、33.3%。

3 討論與小結

3.1 提取方法的選擇 據文獻報道[1-3]，磺胺類、氟喹諾酮類[4-5]藥物可溶于極性有機溶劑、親水性有機酸或有機堿、酸/堿水溶液，對提取液的要求不高，而大環內酯類、四環素類藥物易與畜禽糞便中大量的金屬離子發生螯合反應，并與糞便中的蛋白質發生鍵合[6]，需采用McIlvaine-Na2EDTA緩沖溶液作為提取液，競爭結合金屬離子，同時采用C18粉吸附沉淀糞便中的雜質，保證四類藥物的游離性。結果證明，McIlvaine-Na2EDTA緩沖溶液提取液可以實現對5種抗生素的同時提取。在對實際樣品的分析中發現，親水性C18粉可以吸附提取液中懸浮的基質物質，使上清液更為清澈；疏水性C18粉起不到凈化效果，且不利于下一步的固相萃取操作。同時，結果表明，過量的C18粉會對金霉素、泰樂菌素有一定的吸附作用，這與金霉素、泰樂菌素在C18色譜柱上的保留特性一致；而不加或較少的加入C18粉，會導致固相萃取柱堵塞。

表5實際樣品中5種獸藥的檢測結果表

N.D. : not detected ;

3.2 基質效應的影響 采用液相色譜-串聯質譜法分析目標化合物時，分析物的共流出組分會影響電噴霧接口處的離子化效率從而導致基質效應，并表現為增強或抑制作用。豬糞便質地較細，是一種成分復雜的生物樣品基質，含有有機質15%，對5種獸藥的測定存在明顯的基質效應影響，本實驗使用基質液配置標準品進行定量，以消除基質對結果的影響，但仍無法消除基質對恩諾沙星、金霉素、泰樂菌素的吸附作用，因此要消除基質效應，還應在前處理方法上進行改進。本文采取了三個措施盡可能多的去除掉基質，取得了較好的效果，一是將樣品進行冷凍后分析，并在低溫下離心樣品提取液；二是將提取液調成酸性，并加入適量的C18粉；三是上樣后先用5%甲醇溶液淋洗SPE柱再洗脫，洗脫液不選乙腈，而選擇洗脫能力較弱的甲醇。

3.3 小結 本文建立了同時測定豬糞便中二甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶、恩諾沙星、金霉素、泰樂菌素5種獸藥殘留的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析方法。基于本方法對實際樣品的檢測結果表明，在飼喂過獸藥的動物糞便樣品中，獸藥原型的含量已達到本方法可檢測的線性范圍，該方法具有快速、定性、定量、準確的優點，可用于豬糞便中5種獸藥殘留的定量測定。

[1] 張春燕. 不同環境基質中抗生素和藻毒素的UPLC/MS/MS分析方法建立與應用[D].河北師范大學,2013.

[2] 吳劍平,張鑫,李丹妮,等. 五種抗菌藥物從豬、雞飼料至有機肥中的藥物殘留遷移規律研究[J]. 中國獸藥雜志,2015,05:43-48.

[3] 張丹俊,潘孝成,趙瑞宏,等. 畜禽糞便中抗菌藥物殘留檢測方法研究進展[J]. 動物醫學進展,2008,11:101-103.

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(編輯：陳希)

Simultaneous Determination of Five Veterinary Drug Residuesin Swine Manure by Ultra-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

GU Xin, ZHANG Xin,YAN Feng,WU Jian-ping,LI Dan-ni

(ShanghaiVeterinaryDrugsandFeedstaffsControlinstitute，Shanghai201103,China)

A method for simultaneously detecting Diaveridine,Sulfameter, Enrofloxacin,Chlorotetracycline and Tylosin in swine manureby ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was developed. After having been extracted with McIlvaine-Na2EDTA buffer solution, the sample was purified and concentrated by C18 power and HLB solid phase extraction column. The residue was dissolved by 0.1% formic acid/methanol (85/15).The results showed that five veterinary drugs were determined with a fine linear relationship from 10 to 500μg/kg.There coveries of five veterinary drugs spiked with 50～500 g/kg in swine manure were from 53%～85%withRSDsranging from 1.87% to 18.81%. As a result, the method is seized of high accuracy as well as sensitivity for a rapid determination of fiveveterinary drugs in swine manure.

ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);veterinary drug residues; swine manure

上海市市級農口系統青年人才成長計劃(滬農青字(2014)第2-5號)；上海市科技興農重點攻關項目(滬農科攻字(2014)第3-3號)

顧欣，碩士，研究員，從事獸藥飼料及畜產品質量安全檢測方面研究。E-mail: guxun@sh163.net

2015-08-03

A

1002-1280 (2015) 10-0032-04

S859.796