中藥單體綠原酸對深靜脈血栓形成大鼠Th17/Treg亞群失衡的影響

孫濤，李霞，王彬

(1山東省醫學科學院基礎醫學研究所，濟南250062;2濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院;3濟寧醫學院基礎學院;4山東中醫藥大學附屬醫院)

深靜脈血栓形成(DVT)是常見的周圍血管疾病，急性期易并發致死性肺栓塞。T細胞不同亞群產生不同的細胞因子形成復雜的細胞因子網絡，發揮核心免疫調節作用。調節性T細胞(Treg)和輔助性T細胞17(Th17)，其分化、發育調節機制不同于Th1、Th2，在抑制過度的免疫應答和促進免疫炎癥性反應過程中處于關鍵地位，且與流產后異常子宮出血及DVT發生、發展關系密切［1～3］。我們在前期研究中發現，DVT患者存在Th17型細胞因子表達升高，Th17/Treg亞群失衡參與了DVT的發生與發展［4］。綠原酸是茵陳、金銀花等中藥的主要有效成分，具有抗氧化作用及免疫調節等作用［5］。2013年6月～2014年3月，我們觀察了中藥單體綠原酸干預后DVT大鼠Th17、Treg亞群分化狀態及其特征性細胞因子(IL-17、TGF-β)的表達變化，闡釋綠原酸逆轉Th17/Treg亞群失衡治療DVT的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 Wistar大鼠60只，12周齡，體質量200～250 g，雄性，SPF級，購自山東大學實驗動物中心(許可證號SCXK魯20090001);自由飲水和攝食，室溫25～26℃，相對濕度45%左右;定期紫外線室內消毒，適應性飼養7 d。中藥單體原料藥綠原酸(南京海陵中藥制藥工藝技術國家工程研究中心，純度95.0%;批號060801)，生理鹽水由山東華魯制藥有限公司生產，批準文號國藥準字H37022750;大鼠抗小鼠熒光抗體FITC-CD4購自美國BD Pharmigen公司，IL-17、TGF-β ELISA試劑盒購自美國BD R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將60只大鼠隨機分為6組各10只，A、B、C、D組根據Reyers法建立大鼠DVT模型，分別給予綠原酸40、20、10 mg/kg及等量生理鹽水連續灌胃7 d，自由飲水攝食。E組麻醉后分離下腔靜脈但不予結扎，直接縫合腹膜、皮膚，術后給予生理鹽水連續灌胃7 d。F組不處理，給予生理鹽水連續灌胃7 d。

1.2.2 Th17、Treg亞群檢測 末次藥物處理后次日，大鼠心臟取血，分離血清。無菌分離大鼠脾臟，針栓研磨制成單細胞懸液;200目銅網過濾，調整細胞濃度為1×106/mL，加入佛波酯30 μg/L、離子霉素1 mg/L、莫能霉素1.7 μg/L，37℃，5%CO2孵育4 h。收集細胞，1×PBS洗2遍，去上清，加入小鼠血清，室溫避光孵育30 min。將外標抗體FITC-CD4按說明書加入到細胞懸液中，4℃避光孵育30 min。1×PBS洗2遍，去上清。BD固定穿膜試劑盒固定穿膜(按說明書操作)，加入內標抗體(PE-IL-17、PETGF-β)，4℃避光孵育30 min;穿膜緩沖液洗2次，去上清，PBS重懸細胞，轉管，上機檢測。Winmidin 2.9分析Th17及Treg亞群比例。

1.2.3 血清IL-17、TGF-β檢測 采用ELISA法檢測血清Th17型細胞因子IL-17及Treg型細胞因子TGF-β蛋白表達，按照試劑盒說明操作，每個標本設3個復孔。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。計量資料以s表示，組間比較用One Way-ANOVA方差分析，兩組間比較采用Turkey法檢驗;數據間相關性用Pearson相關性分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組Th17、Treg亞群比例及比值比較 見表1。

表1 各組Th17/Treg亞群比例及比值比較(s)

表1 各組Th17/Treg亞群比例及比值比較(s)

注:與F組比較，aP＜0.05;與E組比較，bP＜0.05;與D組比較，cP＜0.05;與C組比較，dP＜0.05;與B組比較，eP＜0.05。

組別 n Th17亞群(%)Treg亞群(%)Th17/Treg A組 10 11.27±0.68cde 4.43±0.17cde 2.87±0.34cde B組 10 13.45±0.71abcd 4.08±0.16abcd 3.30±0.28abcd C組 10 16.62±0.70abce 3.82±0.18abce 4.32±0.36abce D組 10 18.43±0.84abde 3.06±0.15abde 5.88±0.41abde E組 10 11.48±0.67cde 4.36±0.22cde 2.92±0.26cde F組 10 11.02±0.72cde 4.52±0.19cde 2.71±0.26cde

2.2 各組血清IL-17、TGF-β水平比較 見表2。

表2 各組血清IL-17、TGF-β水平比較(ng/mL，s)

表2 各組血清IL-17、TGF-β水平比較(ng/mL，s)

注:與F組比較，aP＜0.05;與E組比較，bP＜0.05;與D組比較，cP＜0.05;與C組比較，dP＜0.05;與B組比較，eP＜0.05。

組別 n IL-17 TGF-β A組 10 92.44±6.14cde 45.68±3.65cde B組 10 101.25±5.66abcd 41.40±3.52abcd C組 10 114.02±6.53abe 36.88±2.76abe D組 10 117.60±7.05abe 34.52±3.04abe E組 10 94.87±6.24cde 44.04±2.83cde F組 10 89.90±5.65cde 46.62±3.23cde

2.3 Th17/Treg值與血清IL-17、TGF-β的關系 相關性分析顯示，Th17/Treg值與IL-17呈正相關(r= 0.618，P＜0.05)，與TGF-β呈負相關(r=－0.577，P＜0.05)。

3 討論

T細胞是機體免疫調節的主體細胞，在抵御外界病原體感染及維持機體內環境穩定中發揮著重要作用。初始T細胞受抗原刺激后，在分化誘導因子及特異性核轉錄因子作用下分化為不同的亞群，產生特異性細胞因子，主導不同的免疫反應。T細胞經IFN-γ和IL-12誘導分化為Th17亞群，分泌IL-17等細胞因子;IL-2通過誘導T-bet的表達和上調IL-12R β2亞基促進Th17細胞分化，同時它還刺激NK細胞、巨噬細胞的活化生長和增強它們的殺傷能力，加重炎癥反應，參與多種自身免疫疾病［6，7］。初始T細胞經IL-4誘導分化成Treg亞群，分泌TGF-β等細胞因子，激活B細胞，介導體液免疫，能拮抗性抑制Th17型細胞因子介導的炎癥反應，使機體的免疫應答限制在適度范圍，避免過強的炎癥反應導致的組織損傷［8，9］。

Th17細胞和Treg細胞具有共同的起源，相互構成復雜的作用。Th17/Treg亞群相互調節，在生理狀態下處于免疫動態平衡之中，維持機體正常免疫功能及自穩狀態［10，11］，二者比例在某種程度上能夠反映機體免疫系統是處于調控狀態還是炎癥狀態［12，13］。Th17細胞和Treg細胞之間平衡狀態的打破，可能是很多炎癥性疾病及自身免疫性疾病發生、發展的一個關鍵因素。

綠原酸是中藥茵陳的主要有效單體成分。大量的實驗證明，綠原酸是一種自由基清除劑及抗氧化劑。它通過清除氧自由基及抗脂質過氧化，可保護血管內皮細胞，進而對心血管系統產生有效的保護作用。藥理研究證實，綠原酸對免疫功能具有調節作用，可以通過抑制炎癥反應，改善靜脈內皮功能［14，15］。

本研究發現，在DVT模型大鼠Th17亞群比例明顯升高，Treg亞群比例明顯降低，Th17型細胞因子占主導地位。提示Th17/Treg亞群失衡參與了DVT形成過程。綠原酸治療后，DVT大鼠Th17亞群比例及其特征性因子表達顯著降低，Treg亞群比例及抑炎因子表達顯著升高。證實中藥單體通過優勢誘導Treg亞群分化，逆轉Th17/Treg亞群失衡，減少Th17型炎性細胞因子分泌，進而減輕炎癥反應對血管內皮的損傷，抑制血栓形成。經過相關性分析，我們觀察到 Th17/Treg值與 IL-17呈正相關，與TGF-β呈負相關。

本研究證實，Th17/Treg亞群失衡參與了DVT形成過程，中藥單體通過逆轉Th17/Treg亞群失衡，減輕炎癥反應，進而保護血管內皮細胞，發揮治療DVT的作用。但是，DVT中Th17/Treg亞群失衡的根源及中藥單體調節Th17/Treg亞群偏移的分子機制，仍需進一步深入探討。

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