頭孢曲松鈉對慢性神經病理性疼痛的影響及其機制探討

盧麗莉，楊倩，仇艷玲，易力

(1石家莊市第三醫院，石家莊050011;2石家莊市第四醫院; 3河北省優撫醫院)

外周神經損傷可導致神經病理性疼痛，包括痛覺過敏、痛性感覺異常、自發性疼痛。谷氨酸是中樞神經系統最主要的興奮性神經遞質，參與脊髓水平傷害性信息的傳遞及痛覺過敏的形成;因胞外沒有谷氨酸代謝酶，胞外谷氨酸的清除主要依靠谷氨酸轉運體(GLT)。目前，已克隆出5種高親和力GLT［1，2］，其中GLT-1在病理性疼痛和痛過敏的發生和維持中發揮重要作用［3～6］。Rothstein等［7］報道，β-內酰胺類抗生素中的頭孢曲松(Cef)可增加GLT-1表達和谷氨酸攝取，但其是否會對慢性神經病性疼痛過程產生影響尚未報道。2013年10月～2014年3月，我們觀察了Cef對大鼠坐骨神經慢性結扎損傷(CCI)慢性神經病理性疼痛的影響，并觀察脊髓后角組織中GLT-1表達的變化，為臨床上病理性疼痛的防治提供新線索與思路。

1 材料與方法

1.1 分組與造模處理 健康雄性SD大鼠70只，體質量(280±20)g。將動物隨機分為7組各10只，A組僅暴露坐骨神經不結扎，B～F組均行右側CCI［8］制作慢性神經病理性疼痛模型;C、E組分別于術后第1、7天開始于腹腔注射Cef，1次/d，共注射7次;D、F分別與C、E組相同，均同時腹腔注射NS。7組術前第1天，A、B、E、F組術后第1、3、5、7、9、11、14天，C、D組術后第1、3、5、7天，測定熱縮足反射潛伏期、機械縮足反射閾值后，取材觀察GLT-1表達。

1.2 熱縮足反射潛伏期測定 應用BME-410A型熱痛刺激儀(光源為12 V/35 W鹵素燈)進行。測痛實驗臺高36 cm，頂部為2 mm厚的石英玻璃板。將有機玻璃板制成的動物籠(220 mm×220 mm× 280 mm，無底，用有機玻璃隔板隔成3個23 mm×11 mm×28 cm的獨立空間)置于測痛實驗臺頂部的石英玻璃板上，將待測動物置于籠內;調節光源與石英玻璃板之間的距離，使落在足底的照射光圈直徑5 mm，從開始照射至出現縮足逃避反射的時間(s)即為熱刺激縮足潛伏期。重復測量5次，同一部位間隔10 min，不同部位間隔5 min，取平均值。如＞30 s無反應，則停止照射，以免導致大鼠足底組織過熱損傷。

1.3 機械縮足反射閾值測定 應用von-Frey纖維機械刺激器，包括12種刺激強度(0.09、0.18、0.28、0.52、1.12、3.80、5.50、7.70、10.40、18.20、44.00、 61.00 g)。將透明有機玻璃動物籠置于頂部為鐵絲網的36 cm高的測痛實驗臺上，將待測大鼠置于籠中。實驗者手持纖維穿過鐵絲網格分別刺激大鼠兩側足底中心部位，刺激強度由小到大，每個強度刺激10次(次與次間隔3～5 s)，將出現縮足反應5次以上的強度定為大鼠對機械刺激的反應閾值。刺激閾值刺激閾值＞61.00 g均以61.00 g計，＜0.09 g均以0.09 g計。

1.4 脊髓后角GLT-1檢測 采用Western blot法。在預定時間點，將動物迅速斷頭處死，取出L4、L5脊髓節段，將所取標本置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h備用。取L4、L5脊髓節段，切取右側脊髓后角;稱重后加入10倍體積的預冷裂解液，在冰浴下制成勻漿。4℃ 12 000 g離心 10 min，取上清－70℃保存。采用考馬斯亮藍法測定組織蛋白含量后，電泳、轉膜、免疫顯色;應用凝膠圖像分析系統進行相對定量分析，以各處理組樣本與β-actin蛋白的IOD值之比作為蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。計量數據用s表示，組間比較應用單因素方差分析，組內比較應用配對t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組熱縮足反射潛伏期比較 見表1。

表1 各組熱縮足反射潛伏期比較(s，s)

表1 各組熱縮足反射潛伏期比較(s，s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與D組比較，△P＜0.05;與F組比較，#P＜0.05。

組別 術前1 d 術后1 d 術后3 d 術后5 d 術后7 d 術后9 d 術后11 d 術后14 d A組 15.2±1.8 14.0±1.1 15.4±0.8 14.6±1.4 13.5±1.6 13.7±0.8 14.5±1.7 13.9±1.2 B組 14.0±0.9 14.2±0.7 9.5±1.4* 6.6±1.2* 7.5±1.1* 7.4±1.7* 7.2±1.0* 7.7±1.7* C組 14.4±1.2 14.6±1.1 9.2±1.0 9.6±0.5△ 12.3±1.7△ － － －D組 14.1±0.7 14.6±0.4 9.8±0.2 7.1±1.9 6.9±0.7 － － －E組 14.0±1.1 13.7±1.0 9.5±0.6 6.9±1.6 7.7±1.9 7.7±0.5 10.3±0.7# 12.1±1.0# F組 14.3±1.4 14.2±0.8 8.5±0.8 5.8±0.7 7.2±1.3 6.5±1.6 6.7±0.3 6.6±1.1

2.2 各組機械縮足反射閾值比較 各組機械縮足 反射閾值比較，見表2。

表2 各組機械縮足反射閾值比較(g，s)

表2 各組機械縮足反射閾值比較(g，s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與D組比較，△P＜0.05;與F組比較，#P＜0.05。

組別 術前1 d 術后1 d 術后3 d 術后5 d 術后7 d 術后9 d 術后11 d 術后14 d A組 42.1±14.1 38.8±11.5 42.1±14.1 42.1±14.1 48.5±11.5 48.5±11.5 42.1±14.1 42.1±14.1 B組 33.6±14.1 38.8±11.6 10.8±4.3* 7.6±2.9* 6.5±1.8* 7.4±2.7* 6.2±1.9* 4.8±2.0* C組 38.2±16.9 42.5±13.7 10.8±3.9 13.0±4.0 26.8±11.5△ － － －D組 35.4±14.9 26.8±14.9 15.6±4.5 8.6±1.6 7.0±1.3 － － －E組 33.7±14.1 33.7±14.1 14.3±4.5 8.4±1.4 7.2±1.1 9.1±1.5 12.0±3.9 24.7±12.9# F組 35.4±14.9 35.3±15.0 13.0±4.5 9.5±1.6 7.0±1.3 7.3±3.3 5.7±2.0 5.1±2.3

2.3 各組脊髓后角GLT-1蛋白表達比較 A組可見脊髓后角組織中GLT-1蛋白表達，CCI后脊髓后角GLT-1蛋白表達出現雙向性變化;與A組相比較，B組CCI后第1、3、5天脊髓后角組織中GLT-1蛋白表達顯著升高，CCI后第7、9、11、14天脊髓后角組織中GLT-1蛋白表達下降，P均＜0.05。C組CCI后第7天脊髓后角組織中GLT-1蛋白表達較D組顯著升高(P＜0.05)，E組CCI后第14天脊髓后角組織中GLT-1蛋白表達較F組顯著升高(P＜0.05)。見表3。

表3 各組脊髓后角GLT-1蛋白表達比較(s)

表3 各組脊髓后角GLT-1蛋白表達比較(s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與D組比較，△P＜0.05;與F組比較，#P＜0.05。

組別 術前1 d 術后1 d 術后3 d 術后5 d 術后7 d 術后9 d 術后11 d 術后14 d A組 1.60±0.12 1.50±0.11 1.50±0.21 1.60±0.13 1.60±0.22 1.50±0.15 1.60±0.23 1.60±0.13 B組 1.50±0.21 2.20±0.13* 2.70±0.11* 3.30±0.23* 0.70±0.04* 0.50±0.02* 0.50±0.03* 0.40±0.15* C組 1.70±0.13 2.30±0.12 2.70±0.23 3.30±0.21 2.60±0.08△ － － －D組 1.60±0.14 2.20±0.21 2.60±0.13 3.20±0.17 0.60±0.03 － － －E組 1.50±0.14 2.30±0.19 2.70±0.12 3.20±0.21 0.80±0.04 0.50±0.03 0.70±0.05 3.10±0.18# F組 1.60±0.13 2.30±0.18 2.60±0.14 3.30±0.17 0.70±0.10 0.60±0.05 0.50±0.03 0.40±0.02

3 討論

CCI模型是目前神經病理性疼痛研究中應用最廣泛的模型，制作簡便、穩定，能較好地模擬臨床神經損傷后的痛覺過敏現象［8］。CCI模型的特點是用鉻制羊腸線輕度結扎坐骨神經，使粗的有髓鞘纖維選擇性的損傷，但仍保留大部分傳遞疼痛的C類纖維。模型動物術后第3天開始出現痛覺過敏，第5～7天降到最低，痛覺異常狀態可持續2～3個月。本實驗觀察到，CCI大鼠術后第1天在坐骨神經壓迫側即可見足趾部卷曲、足外翻、跋行，行走時著地時間明顯縮短，足部邊緣著地，有明顯的后肢保護現象出現。術后第3天，坐骨神經壓迫側出現痛覺過敏現象，熱縮足反射潛伏期和械縮足反射閾值開始降低，到術后第5～7天達最低值，持續到所測試的第14天。這些變化同文獻報道一致［8］。本研究還發現，CCI大鼠CCI側脊髓后角GLT-1表達出現雙向性變化，術后第1、4天表達明顯升高，第7、14天表達減少。GLT后期階段的下調同與CCI大鼠熱縮足反射潛伏期和械縮足反射閾值降低相一致，因此推測GLT-1對CCI導致的慢性神經病理性疼痛的產生和維持具有重要作用。

最近研究發現［7］，15種β-內酰胺類抗生素(包括青霉素和一些新的衍生物)具有出人意料的新功能，其中Cef可通過血腦屏障進入腦和脊髓。連續腹腔注射Cef 6～7 d后，可以選擇性地誘發編碼GLT-1谷氨酸轉運體的基因轉錄，增加GLT-1的腦內表達，并增強其功能活性。本實驗在CCI術后第1、7腹腔注射Cef，注射7 d后大鼠的熱刺激潛伏期和機械縮足潛伏期明顯延長，且CCI側脊髓后角GLT-1表達明顯增加。表明Cef可通過激動GLT-1對疼痛起到預防和治療作用。

CCI導致的神經損傷誘導了脊髓谷氨酸的釋放及GLT的過度激活，最初GLT的上調為一種保護性的機制［9］，攝取突觸間隙的谷氨酸，減少這種過度激活導致的有害影響。盡管GLT的最初上調不能完全阻止神經病理性痛的發展，但是在阻礙慢性病理性疼痛發展方面發揮了重要作用［10］。有研究表明，神經損傷后反饋性GLT上調，Trk受體和MAPK也發揮了積極的作用［11］;后期GLT下調，可能是由于失去了初級傳入引起的，而且脊髓中的退化性變化也部分導致脊髓膠質細胞型GLT的下調。脊髓GLT表達減少可致脊髓谷氨酸蓄積［12］，使谷氨酸受體過度的激活，產生自發性痛和痛覺過敏。本研究應用Cef激動GLT-1表達后，抑制了CCI后期脊髓GLT表達的下降，使脊髓細胞間隙谷氨酸不會造成慢性蓄積，從而減輕了熱痛敏和機械痛敏的產生;為臨床上預防和治療慢性神經病理性體提供了新的依據與思路。

［1］Ye Z，Sontheimer H.Modulation of glial glutamate transport through cell interactions with the extracellular matrix［J］.Int J Dev Neurosci，2002，20(3-5):209.

［2］O'Shea R.Roles and regulation of glutamate transporters in the central nervous system［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2002 (29):1018-1023.

［3］Sung B，Lim G，Mao J.Altered expression and uptake activity of spinal glutamate transporters following peripheral nerve injury contributes to the pathogenesis of neuropathic pain in rats［J］.J Neurosci，2003，23(7):2899-2910.

［4］Minami T，Matsumura S，Okuda-Ashitaka E，et al.Characterization of the glutamatergic system for induction and maintenance of allodynia［J］.Brain Res，2001，895(1-2):178-185.

［5］Niederberger E，Schmidtko A，Rothstein JD，et al.Modulation of spinal nociceptive processing through the glutamate transporter GLT-1［J］.Neuroscience，2003，116(1):81-87.

［6］Gosselina RD，Damien B，Isabelle D.Upregulation of the GABA transporter GLT-1 in the gracile nucleus in the spared nerve injury model of neuropathic pain［J］.Neurosci Lett，2010，480(2):132-137.

［7］Rothstein JD，Patel S，Regan MR，et al.β-lactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporter expression［J］.Nature，2005，433(7021):73-77.

［8］Bennett GJ and Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat thatproduces disorder of pain sensation like those seen in man［J］.Pain，1988，33(1):87-107.

［9］Mao QX，Yang TD.Amitriptyline upregulates EAAT1 and EAAT2 in neuropathic pain rats［J］.Brain Res Bull，2010，81(4-5):424-427.

［10］Napier IA，Moharnmadi SA，Christie MJ.Glutamate transporter dysfunction associated with nerve injury-induced pain in mice［J］.J Neurophysiol，2012，107(2):649-657.

［11］Danbolt NC.Glutamate uptake［J］.Prog Neurol，2001，65(1):1-105.

［12］楊娜，隋峰，姜廷良.神經性疾病相關的谷氨酸轉運體研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(7):255-258.