豬干擾素α質粒-PLL聚合體對豬PRRSV弱毒疫苗免疫增強作用研究

楊竹鳴，陳善真，李其昌，劉小琴，王貴平，范紅結，李中圣

（1.廣東海大畜牧獸醫研究院，廣東 廣州510630；2.南京農業大學，江蘇 南京210095）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起的一種惡性傳染病，該病發病率高、傳播快，嚴重危害養豬業的發展。PRRSV感染機體引起的免疫抑制和持續性感染一直是PRRS防控的難點。目前，PRRS主要的預防手段仍然是注射疫苗，無論是PRRSV滅活苗還是弱毒疫苗，不能刺激體內產生強烈的清除病毒的免疫反應，只能通過誘導產生高滴度中和抗體限制PRRSV的繼續感染。細胞因子具有免疫佐劑效應，諸多研究表明，細胞因子可在不同程度上增加滅活苗、弱毒苗、亞單位疫苗，以及核酸疫苗的免疫效應[1]。IFNα屬于Ⅰ型干擾素，主要是通過對Th1細胞和巨噬細胞的調節和對MHC I類分子的誘導表達起調節作用[7]。由于PRRSV具有免疫抑制的病毒感染機制，在PRRSV免疫中，配合可提高機體T淋巴細胞分化作用的細胞因子佐劑可明顯改善疫苗免疫效力[3-8]。豬IFNα（PIFNα）在獸醫臨床中的應用研究證明，肌肉注射PIFNα表達質粒，質粒被肌肉細胞攝取后，重組蛋白的分泌表達效率極低。為使質粒DNA在體內高效表達，學者們已做了許多關于免疫途徑研究，通過基因槍注射質粒或者將質粒注射到淋巴結中來提高質粒在體內的表達效率，但是仍然沒有很好的解決提高質粒在體內表達效率的問題。本試驗首先將重組質粒pVAX1-PIFNα與一種陽離子多聚體-PLL聚合為：PLL-pVAX1-PIFNα，然后利用PLL-pVAX1-IFNα聯合PRRSV弱毒疫苗對豬進行免疫，通過檢測PRRSV中和抗體水平評估重組PIFNα對PRRSV弱毒疫苗的增強作用；通過細胞試驗，驗證了質粒復合物對豬外周血淋巴細胞的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達重組質粒：pVAX1-PIFNα，由我實驗室構建保存；陽離子多聚體：PLL（多聚賴氨酸），為Sigma公司產品。8周齡長白豬，經ELISA檢測PRRSV抗體陰性。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗JXA1-R株（20頭份），廣東某疫苗公司產品。豬IFN-γ檢測試劑盒，購自上?？婆d商貿有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）中和抗體ELISA檢測試劑盒，為法國LSI專業診斷試劑。

1.2 pVAX1-PIFNα質粒與PLL的聚合 方法：1 mL的濃度為969.1 ng/μL的pVAX1-PIFNα質粒與1mL的濃度為1 ng/μL的PLL混合備用，即1.938 μg的pVAX1-PIFNα質粒與0.4μg的PLL混合，凝膠電泳法驗證復合效果。

1.3 細胞試驗 60日齡健康豬，前腔靜脈采血50mL，抗凝處理，抗凝血中加入紅細胞裂解液冰浴中裂解，棄掉上清，加入高壓滅菌的PBS清洗細胞3次，最終用12 mL 1640培養液重懸細胞。細胞稀釋后加入12孔細胞培養板中，細胞密度為1×106/well。

按照Lipofectamine 2000使用說明分別做以下3組轉染試驗。A組：PLL-pVAX1-PIFNα；B組：pVAX1-PIFNα；C組：pVAX1空白質粒（陰性對照），每組4個重復，置于CO2培養箱中37℃培養，分別在12、24、48 h取細胞培養液，ELISA法檢測細胞培養液中PIFN-γ的表達水平。

1.4 動物免疫 挑選20頭30日齡RRSSV抗體陰性豬，分為4組，每組5頭。如表1，1-3組設置為免疫組，第4組注射生理鹽水，作為空白對照組，注射后各組隔離養殖。免疫用PRRSV疫苗為：PRRSV JXA1-R株弱毒苗。所有試驗豬均采取耳后頸部注射。

表1 分組情況

分別在免疫前、免疫后第8、16、24、31、44天于豬前腔靜脈采血，分離血清，用法國ELISA檢測試劑盒檢測PRRSV中和抗體。

2 結果

2.1 細胞試驗中IFN-γ的檢測 經ELISA法檢測，檢測到在細胞試驗第12、24、48小時，加PLLpVAX1-PIFNα的A組檢測到的IFN-γ的量均顯著高于加pVAX1-PIFNα的B組（P＜0.05），對照組的中和抗體水平未見明顯變化（如圖1）。

圖1 T細胞分泌的IFN-γ的檢測

2.2 免疫豬的中和抗體水平的檢測 本試驗中（如圖2），經檢測，疫苗免疫后第8天尚未產生PRRSV中和抗體，在免疫后第16天中和抗體開始升高。在免疫檢測的44 d內，PLL-pVAX1-PIFNα注射組的抗體水平顯著高于其他3組（P＜0.05）；pVAX1-PIFNα注射組的中和抗體水平與只注射PRRSV弱毒苗組的水平相當，說明pVAX1-PIFNα質粒未明顯提高免疫水平；對照組的中和抗體水平未見明顯變化。

3 討論

圖2 PLL對機體免疫反應的作用

近幾年，對PRRSV的研究在分子生物學方面取得了顯著進展，對其感染機體引起的免疫抑制和持續性感染的分子機制也有了進一步認識。PRRSV感染引起的免疫抑制和持續性感染的主要原因非常復雜。一方面，豬感染PRRSV野毒株或機體免疫弱毒疫苗，不能刺激體內產生強烈的清除病毒的免疫反應，雖然PRRSV感染后N蛋白和M蛋白能夠較早誘導機體產生抗體，但是這兩種早期產生的抗體在體內外均不能有效中和PRRSV，疫苗免疫后期出現的高水平中和抗體無法清除免疫系統內部的病毒粒子。另一方面，PRRSV的病毒感染機制有效降低了體內T細胞對病毒的防御作用。研究發現，分泌IFN-γ的PRRSV特異性T細胞和高滴度中和抗體是介導強烈的殺傷病毒免疫反應的主要因素[2]。IFNα一方面具有啟動細胞內抗病毒蛋白大量表達的級聯反應機制，同時也可通過對Th1細胞的調節促進效應細胞分泌IFN-γ，進一步介導機體對病毒的清除作用。PRRSV不同于其他病毒，感染豬后會抑制體內IFNα的產生。對于豬IFNα的應用，已有很多報道，豬干擾素α蛋白在原核表達系統和真核表達系統中得到表達，其細胞免疫激活功能也得到驗證[8-10]。然而，普遍的研究發現，蛋白形式的豬IFNα存在半衰期短、易被降解、蛋白純化成本較高等一系列問題，為此，本文嘗試直接利用PIFNα真核表達質粒配合疫苗免疫，以提高PRRSV疫苗免疫過程中的T細胞免疫水平。

本試驗將pVAX1-PIFNα重組質粒與多聚賴氨酸（PLL）聚合，聯合PRRSV弱毒疫苗免疫試驗豬，探討聚合體形式的豬IFNα對PRRSV疫苗免疫增強作用。PLL是一種極性較強的大分子物質，作為一種陽離子多聚物被廣泛用來凝結DNA質粒，凝結為微粒狀和短棒狀的聚合物可以被細胞通過非特異性的和細胞受體介導的內吞作用進入細胞[11-12]。本試驗利用PLL載體的聚合作用，將pVAX1-PIFNα質粒凝結為聚合物PLL-pVAX1-PIFNα。聚合體狀態的PLL-pVAX1-PIFNα可降低質粒在機體內降解的進程，延長其對免疫細胞的刺激時間[13-14]。近年來，非病毒載體這一技術被廣泛用于醫學上腫瘤的基因治療中[15-16]，學者們在多聚物基因載體上加上具有細胞靶向性的基團，以實現質粒DNA在指定的某類細胞中表達[17]。如果將這一技術應用到動物疾病的治療中，將為動物醫學的發展做出巨大的貢獻。

研究報道，在PRRSV感染初期，在豬體內注射含豬IFNα的非復制性腺病毒載體DNA，發現外源IFNα的增加推遲了病毒血癥的出現，降低了血液中病毒的滴度[18]，說明在PRRSV感染期，外源IFNα可以增強機體對PRRSV的天然免疫和獲得性免疫。在本文的細胞試驗中，分別應用pVAX1-PIFNα和PLL-pVAX1-PIFNα刺激豬淋巴細胞，IFNα可直接刺激IFN-γ等Th1細胞因子的激活，進而調動免疫細胞的抗原呈遞作用和免疫系統對病毒的清除作用。聚合體狀態的PLL-pVAX1-PIFNα可以更為有效地刺激淋巴細胞分泌IFN-γ，其原因一方面可能在于聚合體質粒不易降解，延長了質粒對細胞的作用時間；另一方面，PLL可能促進了轉染試劑的效率，從而提高了細胞對質粒的攝取作用。與單純的質粒相比，聚合體狀態的PLL-pVAX1-PIFNα有效提高了PRRSV疫苗的免疫效力，這與IFNα對機體先天免疫系統的早期激活及病毒粒子的及時清除有密切關系。作者根據PRRSV活疫苗免疫現狀，嘗試一種在獲得性免疫激活的同時加強機體先天免疫的方法，為獸用干擾素的臨床應用提供了有益參考，也為功能質粒的臨床應用提供了有力借鑒。

[1] Wasin Charerntantanakul.Adjuvants for porcine reproductive and respiratory syndrome virus Vaccines[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，2009，129：1-13.

[2] Lopez-Fuertes L，Domenech N，Alvarez B，etal.Analysis of cellular immune response in pigs recovered from porcine respiratory and reproductive syndrome infection[J].Virus Res，1999，64：33-42.

[3] Deendayal Patel，Yuchen Nan，Meiyan Shen，etal.Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Inhibits Type I Interferon Signaling by Blocking STAT1/STAT2 Nuclear Translocation[J].Journal of virology，2010，84（21）：11045-11055.

[4] Rui Luo，Liurong Fang，Hui Jin.Antiviral activity of type Iand type III interferons against porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）[J].Antiviral Research，2011，91：99-101.

[5] Mounira K，Chelbi Alix，Juana Wietzerbin.Interferon a growing cytokine family：50 years of interferon research[J].Biochimie，2007，89：713-718.

[6]Cláudio A，Bonjardim，Paulo C Ferreira P.Interferons：Signaling，antiviraland viral evasion[J].Immunology Letters，2009，122：1-11.

[7]Yongming Sang，Raymond R R Rowland，Frank Blecha.Porcine type I interferons：polymorphic sequences and activity against PRRSV[J].BMC Proceedings，2011，5（Suppl 4）：S8.

[8]李鵬飛，李明，程健，等.豬干擾素α基因的克隆與真核表達[J].中國生物制品學雜志，2010，4：369-372.

[9]楊永勝，陳春花，宋勤葉，等.豬α1干擾素基因的克隆與原核表達[J].中國農學通報，2010，26（11）：1-6.

[10]Chung H K，Lee JH，Kim SH，etal.Expression of Interferon-a and Mx1 Protein in Pigs Acutely Infected with Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus（PRRSV）[J].Comp JPath，2004，130：299-305.

[11]James A Mason，Christian Leborgne，Gilles Moulayb，etal.Optimising histidine rich peptides for efficient DNA delivery in the presence of serum[J].Journal of Controlled Release，2007，118（1）：95-104.

[12]Mark A Borden，Charles F Caskey，Erika Little，et al.DNA and Polylysine Adsorption and Multilayer Construction onto Cationic Lipid-Coated Microbubbles[J].Langmuir，2007，23（18）：9401-9408.

[13]Gon?alves C，Pichon C，Guérin B，et al.Intracellular processing and stability of DNA complexed with histidylated polylysine conjugates[J].The journal of genemedicine，2002，4：271-281.

[14]Maria T Santini，Cesare Cametti，Pietro L Indovina.Polylysine induces changes in membrane electrical properties of K562 cells[J].Journal of Biomedical Materials Research，1997，35：165-174.

[15]Eunjung Jeon，Hee-Doo Kim，Jin-Seok Kim.Pluronic-grafted poly-（L）-lysine as a new synthetic gene carrier[J].Journal of BiomedicalMaterials Research，2003，66（4）：854-859.

[16]Paul de Vos1，Chris G Hoogmoed，Henk JBusscher.Chemistry and biocompatibility of alginate-PLL capsules for immunoprotection of mammalian cells[J].Journal of BiomedicalMaterials Research，2002，60：252-259.

[17]Swet Chand Shukla，Amit Singh，Anand Kumar Pandey，et al.Review on production and medical applications of?-polylysine[J].Biochemical Engineering Journal，2012，65（15）：70-81.

[18]Susan LBrockmeier，Crystal L Loving，Eric A Nelson，etal.Presence of interferon-αat the time of infection alters the innate and adaptive immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Clin Vaccine Immunol，2012，19（4）：508-514.