CD44v6在胃神經內分泌癌中的表達及其意義

謝建偉， 黃昌明， 鄭朝輝， 李　平， 王家鑌， 林建賢

CD44v6在胃神經內分泌癌中的表達及其意義

謝建偉， 黃昌明， 鄭朝輝， 李平， 王家鑌， 林建賢

摘要:目的探討腫瘤干細胞表面標記物CD44v6在胃神經內分泌癌中的表達及其意義。方法免疫組織化學方法檢測50例胃神經內分泌癌組織和相應癌旁組織中CD44v6蛋白的表達情況，分析CD44v6與胃神經內分泌癌臨床病理特征及預后之間的關系。結果CD44v6在胃神經內分泌癌中的表達率為52.0%，在癌旁組織中未見表達，兩者差別有統計學意義(P<0.05)。CD44v6與浸潤深度、N分期、TNM分期和細胞類型相關。CD44v6表達陽性與表達陰性患者術后5年生存率分別為19.4%和54.2%，差別有統計學意義(P<0.05)。單因素分析提示，浸潤深度、N分期、TNM分期、CD44v6高表達是影響患者預后的相關因素；多因素分析提示，CD44v6高表達和N分期為胃神經內分泌癌的獨立預后因素。結論CD44v6參與胃神經內分泌癌浸潤和淋巴結轉移過程，可能是治療胃神經內分泌癌的潛在靶點之一。

關鍵詞:胃腫瘤； 癌,神經內分泌； 干細胞； 生物學標記； 抗原，CD44； 預后

作者單位: 福建醫科大學 附屬協和醫院胃外科，福州350001

胃神經內分泌癌是胃癌中較為罕見的一種，具有強烈的侵襲和轉移特性，預后差[1-4]。胃癌干細胞在胃癌的發生、發展、復發和轉移中扮演重要角色[5-6]。有研究表明，腫瘤干細胞表面標志物CD44v6可介導細胞之間、細胞與基質之間的特異性識別、粘附作用，增強腫瘤細胞的趨化行為，促進腫瘤的浸潤轉移[7-8]。目前，CD44v6在胃神經內分泌癌中的作用尚不十分清楚。本研究通過免疫組織化學檢測胃癌組織中CD44v6蛋白的表達，探討CD44v6與胃神經內分泌癌患者臨床病理特征及預后之間的關系。

1資料與方法

1.1一般資料收集2006年1月-2010年6月行根治性手術切除的胃神經內分泌癌標本50例，男性30例，女性20例，年齡中位數60.64歲(38～82歲)；小細胞神經內分泌癌20例，大細胞神經內分泌癌30例；行根治性全胃切除34例，根治性遠端胃大部切除16例。TNM分期[9]:Ⅰ期0例 ，Ⅱ期13例，Ⅲ期37例，Ⅳ期0例。患者的臨床病理資料采用“胃癌外科臨床數據管理與分析系統”進行收集[10]。確診主要依據H-E染色下細胞的形態特點和免疫組織化學特異的神經內分泌標記，包括嗜鉻顆粒蛋白A(chromogranin A，CGA)、突觸素(synaptophysin，SYN)、神經元特異性烯醇化酶(neuro specific enoclase，NSE)和CD56。患者術前均未行放、化療。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色常規石蠟包埋切片，H-E染色，每例癌組織旁均有鄰近非癌組織(距離腫瘤≥5 cm處)作為對照。免疫組織化學染色采用SP法。廣譜二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；鼠抗人CD44v6單克隆抗體(英國Abcam公司)。免疫組織化學染色程序按試劑盒說明書進行，主要包括10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、4 μm連續切片、常規脫蠟至水、抗原修復、3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶、山羊血清封閉、滴加一抗后4 ℃過夜、二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物、DAB顯色、對比染色封片。CD44v6的稀釋比為1∶2 000，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2結果判定CD44v6以細胞質出現棕黃色顆粒為陽性。根據染色程度和染色細胞百分率進行評定和分析：不著色為0分，淺粉色或黃色為1分，粉色或棕黃色為2分，紅色或黃褐色為3分；著色細胞占計數細胞的百分率低于5%記0分，5%～24%記1分，25%～50%記2分，>50%記3分。由2位資深病理科醫師雙盲下獨立進行結果判定。在低倍鏡下(×40)每張切片隨機觀察5個視野，所得結果取平均數，將染色程度與染色細胞百分率得分相乘，其乘積為最后得分。0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性()，>6分為強陽性()，其中(-)和(+)定為陰性，()和()定為陽性[11]。

1.2.3隨訪情況術后隨訪由專人負責，采用門診、電話、信件、上門等方式進行，隨訪頻率為患者術后2年內，每3月隨訪1次，2年后每6～12月隨訪1次。記錄的生存時間為手術時間至末次隨訪時間，或死亡時間,或隨訪數據庫截止的時間(2015年5月)。

1.3統計學處理采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析。計量資料的比較采用t檢驗，計數資料的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗。用Spearman方法對CD44v6與臨床病理特征相關性進行分析；用Life-Table法進行生存分析。Kaplan-Meier法制作生存曲線，生存率的比較采用Log-rank法檢驗。應用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。

2結果

2.1CD44v6蛋白在胃神經內分泌癌中的表達CD44v6主要表達在胃神經內分泌癌組織的細胞質，陽性表達率為52.0%(26/50)，癌旁組織不表達，兩者差別有統計學意義(χ2=31.58，P=0.005，圖1)。

A：CD44v6在胃神經內分泌癌組織陽性表達；B：CD44v6在癌旁組織陰性表達.圖1　CD44v6在胃神經內分泌癌及癌旁組織中的表達(　×200)Fig 1　The expression of CD44v6 protein in gastric neuroendocrine cancer and non-cancerous tissues (　×200)

2.2CD44v6蛋白表達與臨床病理特征的關系CD44v6表達與浸潤深度、N分期、TNM分期及細胞類型相關，而與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、手術方式無關(表1)。

2.3CD44v6蛋白表達與患者預后的關系全組患者的中位生存時間為48月，術后5年生存率為38.7%(圖2A)。CD44v6蛋白表達陽性與表達陰性患者的中位生存時間分別為25和48月，術后5年生存率分別為19.4%和54.2%，差別有統計學意義(P<0.05，圖2B)。單因素分析提示,CD44v6高表達、浸潤深度、N分期和TNM分期與預后密切相關。多因素分析提示,CD44v6高表達和N分期為胃神經內分泌癌的獨立預后因素(表2)。

表1CD44v6蛋白表達與胃神經內分泌癌臨床病理特征的關系

Tab 1Correlation between CD44v6 expression and clinical variables of gastric neuroendocrine cancer patients

臨床病理參數nCD44v6n陽性χ2P性別0.8550.355 男3014 女2012年齡/歲0.0870.768 ≤602613 >602413d腫瘤/cm1.2020.273 ≤63118 >6198腫瘤部位5.1290.077 胃上部2517 胃中部145 胃下部114細胞類型6.4640.020 小細胞206 大細胞3020浸潤深度5.9530.015 T1~T281 T3~T44225淋巴結轉移10.4220.001 N0163 N13423TNM分期4.2760.039 Ⅱ144 Ⅲ3622手術方式1.9820.159 TG3420 DG166

TG：根治性全胃切除；DG：根治性遠端胃大部切除.腫瘤直徑平均值(6.0 cm)；根據NCCN臨床實踐指南(2014)將N分期分為N0和N1.

3討論

CD44是一種跨膜糖蛋白，屬于黏附分子家族，是透明質酸主要的細胞表面受體。2009年首次被發現為胃癌干細胞表面標記物并可用于識別胃癌干細胞，參與胃癌細胞的粘附、遷移和侵襲[12]。近來研究發現，CD44與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，從而被認為是腫瘤轉移相關基因[13]。變異型CD44由變異的外顯子v1~v10構成，其中以含有外顯子v6的CD44變異體即CD44v6與腫瘤侵襲、轉移的關系最為密切。在一項關于黏膜下胃癌的研究中，Okayama等發現，CD44v6是顯示淋巴結轉移的唯一指標[7]。筆者前期在胃腺癌的研究也發現，CD44v6與浸潤深度、淋巴結轉移、Lauren分型和TNM分期密切相關。CD44v6陽性的患者5年生存率較陰性患者差(38.8%vs73.6%)[14]。本研究發現,CD44v6在胃神經內分泌癌中的表達率明顯高于癌旁組織(P<0.05)。CD44v6與浸潤深度、N分期、TNM分期和細胞類型相關。這些結果再次證實，在不同病理類型的胃癌中，CD44v6都參與腫瘤的浸潤、轉移和侵襲，推測對CD44v6的研究可能具有較好的潛在臨床應用價值。

表250例胃神經內分泌癌患者Cox模型多因素預后分析

Tab 2Multiple stepwise regression analysis with the Cox proportional hazards model of gastric neuroendocrine cancer patients

臨床病理指標回歸系數標準誤WaldP相對危險度95%CITNM分期0.3420.5020.4640.4961.4080.526~3.765浸潤深度0.7391.0530.4930.4832.0930.266~16.473N分期2.2891.0694.5850.0329.8701.214~80.252CD44v6表達1.2260.5435.0970.0243.4071.175~9.875

A：全組患者生存曲線；B：CD44v6表達陽性組和陰性組生存曲線的比較(P=0.000).圖2　50例胃神經內分泌癌患者預后Fig 2　The prognosis of 50 gastric neuroendocrine cancer patients with lymph node metastasis and CD44v6 expression

胃神經內分泌癌是一種少見的胃癌，絕大多數患者在診斷時已為進展期或晚期。目前臨床上多采用以手術為主的綜合治療，其預后較一般胃腺癌更差[15]。本研究發現，CD44v6表達陽性患者預后明顯較表達陰性患者差(P<0.05)。單因素和多因素分析也提示，CD44v6高表達為胃癌的獨立預后因素之一，說明CD44v6表達陽性有助于早期判斷胃神經內分泌癌的預后。

綜上所述，腫瘤干細胞表面標記物CD44v6與胃神經內分泌癌進展、轉移和侵襲能力密切相關。本研究結果將為進一步研究CD44v6的功能及作用機制提供理論依據，也為胃癌神經內分泌癌靶向治療提供思路。

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(編輯：何佳鳳)

《福建醫科大學學報》

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The Expression and Clinical Value of CD44v6

in Gastric Neuroendocrine Carcinoma

XIE Jianwei, HUANG Changming, ZHENG Chaohui, LI Ping, WANG Jiabin, LIN Jianxian

Department of Gastric Surgery, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression and significance of tumor stem cell surface marker CD44v6 in gastric neuroendocrine carcinoma.MethodsWe identified the expression of CD44v6 protein in 50 cases of resected gastric neuroendocrine carcinoma tissues and corresponding peritumoral tissues by immunohistochemistry, to investigated the association between the expression and the clinicopathologic factors and prognosis.ResultsThe expression rate of CD44v6 was significantly greater in gastric neuroendocrine carcinoma than in peritumoral tissues (52.0% vs 0, P<0.05), The expression of CD44v6 was related to depth of invasion, lymph node metastasis, TNM stage and cell classification.The 5-year survival rates of patients with positive and negative expression were 19.4% and 54.2%(P<0.05), respectively.Univariate analysis showed that the prognosis was significantly correlated with depth of invasion, lymph node metastasis, TNM stage, tumor size, and high CD44v6 expression.But only high CD44v6 expression and lymph node metastasis were independent prognostic factors on multivariate analysis.ConclusionsCD44v6 plays an important role in invasion and lymph node metastasis, and may serve as one of the potential therapeutic target of gastric neuroendocrine carcinoma.

KEY WORDS:stomach neoplasms; carcinoma, neuroendocrine; stem cells; biological markers; antigens, CD44; prognosis

通訊作者:黃昌明. Email:hcmlr2002@163.com

作者簡介:謝建偉(1979-)，男，副主任醫師，醫學碩士

基金項目:國家自然科學基金(81441123)；中國臨床腫瘤學科學基金(Y-N2014-008)；福建省自然科學基金(2014J01322)

收稿日期:2015-06-16

中圖分類號:R341.32； R392.11； R735.2； R977.6

文獻標志碼:A

文章編號:1672-4194(2015)05-0280-04