對水質檢測中菌落計數結果質量控制的探討

（山東省濰坊市市政公用事業管理處，261041，濰坊）

一、材料與方法

1.樣品來源

美國IDEXX菌落總數質控樣品、濰坊市中心城區管網末梢水及濰坊市峽山水庫地表水。

2.檢測方法

依據《生活飲用水標準檢驗方法微生物指標》（GB/T 5750.12—2006）中的平皿計數法進行實驗分析，培養基采用北京奧博星生物科技有限責任公司生產的營養瓊脂，批號為20140102，并在有效期內使用。

二、結果與分析

在水質菌落總數檢測過程中，對檢測結果引起誤差的因素主要有培養基、重復性、檢測時間、培養時間、培養溫度、傾注平板時培養基溫度、同一稀釋度平行平板讀數、不同稀釋度平行平板讀數、不同實驗人員對同一水樣菌落總數的讀數等。結合山東省濰坊市水質的特點，主要討論培養基、檢測時間、培養時間、平行平板重復性、不同人員對同一平板讀數等5個因素。

1.培養基對檢測結果的影響及控制措施

培養基是微生物賴以生存的生命之本，培養基制備直接影響著微生物的生長，進而影響了檢測結果。因此，應嚴格按照培養基的配方及說明認真制備培養基，每批培養基在使用前都要進行符合性驗證，主要包括陽性對照及無菌試驗。本實驗采用大腸埃希氏菌（ATCC25922）進行劃線培養，計算生長指數G，結果為G=13（G≥6時培養基可以接受），并且經空白測定證明無菌。因此，本批次培養基可以進行菌落總數的測定。

2.檢測時間對菌落總數結果的影響

國家標準規定微生物水樣保存時間為4 h，但是在實際工作中有時候因采樣地點路程較遠等因素，不能在4 h內完成檢測。將質控菌片溶解后立即檢測，經4℃冷藏存放2 h、4 h、6 h、8 h、23 h、24 h、30 h、48 h、72 h后分別檢測，結果如圖1所示。

從圖1可以看出，對質控菌片用無菌生理鹽水溶解后立即檢測、間隔2 h到23 h后檢測，菌落總數結果變化不明顯，均在20 CFU/mL左右，符合真值20 CFU/mL；從24 h開始，數值呈現較大的變化趨勢，并逐漸超出質控樣可接受范圍（2～38 CFU/mL）。由此可見，檢測時間對菌落總數結果可靠性影響較大，由于細菌的繁殖隨時間呈幾何級數增長，在室溫條件下存放水樣更會導致細菌的繁殖，因此微生物水樣必須在4℃冷藏，取來后應立即檢測，最長不宜超過24 h。

圖1 檢測時間對檢測結果的影響

3.培養時間對菌落總數結果的影響

分別對菌落總數質控樣品和含菌量較高的水樣品進行菌落總數檢測，不同的培養時間對菌落總數的影響呈現一定的變化趨勢，具體如圖2所示。

從圖2可以看出，細菌種類單一的質控樣品培養在24 h～48 h～72 h之間，結果沒有發生較大的變化，在平板計數時只是菌落大小隨時間增長有所增大，數量變化不大。然而，含菌量較高的水樣品，細菌種類較復雜，隨著培養時間的延長，變化趨勢比較明顯。培養24 h時菌落總數小于200 CFU/mL，在24 h～46 h間結果逐漸上升，在46 h～50 h間菌落總數基本沒有發生變化，從70 h開始菌落總數明顯增高。因此，在日常水樣檢測中，培養時間是影響結果準確的主要因素之一，應規范操作，將培養時間控制在48±2 h為宜。

圖2 培養時間對菌落總數檢測結果的影響

4.不同檢測人員對同一菌落讀數結果的影響

采用7位檢測員對同一平板進行菌落計數，并對結果進行統計，計算平均值、誤差率以及可接受區間，具體結果見表1。

表1 7位實驗人員對同一平板計數的結果

從表1中可以看出，7位實驗人員的計數結果均在可接受范圍之內，與均值誤差率小于5%，最大值與最小值誤差為8.86%，滿足不同人員對同一平板計數誤差小于18.2%的北歐標準。因此，就本實驗室而言，不同人員對同一平板讀數引起的誤差較小，在實際工作中可以作為次要因素考慮。

5.樣品重復性測定

在微生物檢驗中，樣品中細菌分布的均勻性和重復測定帶來的誤差是影響檢測結果的主要因素之一。根據濰坊地區水質的特點，對三種細菌密度的水樣進行測定。

（1）質控樣品的重復性測定

采用美國IDEXX公司生產的HPC/TVC（E.faecalis）質控樣品，真值20 CFU/mL，可接受范圍2～38 CFU/mL，重復檢測20次，檢測結果如表2所示。

平板間誤差規定要求≤10%，但在實際工作中有時不易達到。從表2中可以看出，最大值與最小值的誤差為28.57%，大于10%，但20次檢測結果均接近于真值，相對標準偏差為9.72%。周紅雨曾在《泊松分布應用于菌落總數質量控制》一文中闡明，當時，平行平板a1、a2之間的計數結果較理想。從表2中可知，20組數據符合泊松分布，最大值為24 CFU/mL，最小值為18CFU/mL，符合上述公式。因此，在實際檢測工作中，當菌落總數測定值為10～30 CFU/mL時，可以用判定平行平板檢測結果的準確性。

表2 質控樣品重復測定結果

表3 菌落總數較低時，水樣品菌落總數重復性測定結果

表4 菌落總數較高水樣品菌落總數重復性測定結果

（2）水樣品重復性測定

在日常水質監督檢測時，由于各縣市區水質特點、生產工藝等有所差別，因此出廠水及管網水的菌落總數結果各有不同。通過對2010—2014年濰坊地區生活飲用水衛生狀況進行監測，發現大多數水廠消毒較好，菌落總數檢測結果在30 CFU/mL以下，甚至有些水廠的出廠水、管網水菌落總數未檢出，只有個別水廠水樣結果偏高甚至出現超標情況。結合工作實際，對這兩種情況的重復性分別分析，初步確定平行平板間的判定標準，為以后的工作提供參考。

①菌落計數結果小于10CFU/mL時的重復性

在生活飲用水菌落總數測定時，菌落總數結果較低，此時重復性測定如表3所示。

根據北歐標準規定，自身同一梯度平行加樣兩皿間的相對誤差小于7.7%。但是，實際工作有時很難達到此標準，特別是在菌落總數較低時，如表3中的數據顯示，菌落總數均小于10 CFU/mL，相對標準偏差達到38.25%。然而通過計算可知，表3中數據符合，并且Grubbs檢驗后均無異常值。因此，菌落總數測定結果小于10 CFU/mL時，可以用判定平行平板檢測結果的準確性。

②菌落計數結果為30～300CFU/mL時的重復性

將峽山水庫水樣稀釋10倍，重復測定20次，以此反映菌落總數結果較高時的重復性，僅供參考。結果如表4所示。

從表4中可以看出，菌落計數結果在30～300 CFU/mL時，相對標準偏差為4.4%，符合北歐標準。而且通過計算可知，表4數據符合，經Grubbs檢驗后均無異常值。可見，菌落總數較高時精密度較高，結果更準確。當菌落計數結果在30～300 CFU/mL之間時，可以用a1+判定平行平板檢測結果的準確性。

三、結 論

①在生活飲用水菌落總數質控過程中，除了設施環境、培養基、培養箱溫度等硬件需滿足要求外，樣品重復性、檢測時間、培養時間、檢測人員讀數等也是影響結果的主要因素，不同人員對同一平板讀數引起的誤差較小，在實際工作中可以作為次要因素考慮。

②檢測時間和培養時間是質量控制的主要因素之一，應嚴格規范操作。微生物水樣的運輸及保存均應冷藏，樣品取來后應立即檢測，最長不宜超過24 h。

③培養時間因樣品細菌種類的純度對結果的影響有所不同。對于細菌種類單一的質控樣品，隨著培養時間的增長，其結果沒有明顯的變化；而對于種類復雜的水樣品，培養時間對其結果的影響較大，培養時間最好控制在48±2 h。

④菌落總數的高低可能會導致重復性的不同。計數結果在30～300 CFU/mL之間時，精密度為4.4%，重復性好；計數結果較低（小于10 CFU/mL）時，精密度為38.25%，重復性較差；計數結果在10～30 CFU/mL之間時，精密度為9.72%，重復性較好。

[1]北歐食品分析委員會.微生物實驗室質量保證準則[S].1994.

[2]張宗寶.誤差率結合標準差對活菌計數進行質控的應用體會[J].中國衛生檢驗，1995，5（5）.

[3]周紅雨.泊松分布應用于菌落總數的質量控制[J].中國衛生檢驗，2000，10（6）.

[4]中華人民共和國衛生部.生活飲用水標準檢驗方法（GB/T 5750—2006）[S].2007.

[5]中華人民共和國建設部.城市供水水質標準（CJ/T 206—2005）[S].2005.