全反式維甲酸對宮頸癌耐藥細胞株HeLa/MMC侵襲、轉移能力的影響及其分子機制研究

胡海燕 劉植華

南方醫科大學附屬深圳市婦幼保健院，廣東深圳518000

全反式維甲酸對宮頸癌耐藥細胞株HeLa/MMC侵襲、轉移能力的影響及其分子機制研究

胡海燕 劉植華▲

南方醫科大學附屬深圳市婦幼保健院，廣東深圳518000

目的觀察全反式維甲酸(ATRA)對宮頸癌耐藥細胞株HeLa/MMC侵襲、轉移能力的影響，并探討其分子機制。方法分別用不同濃度ATRA(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)處理對數生長期HeLa/MMC細胞，以Transwell小室檢測細胞侵襲、轉移能力的變化;采用CCK-8法檢測經1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5mol/L ATRA處理后的細胞增殖情況;通過流式細胞儀觀察1×10-6mol/L ATRA處理HeLa/MMC細胞3、7 d后細胞周期的變化;半定量RT-PCR檢測1×10-6mol/L ATRA處理HeLa/MMC細胞3、7 d后細胞c-myc mRNA水平變化。結果①Transwell小室結果顯示，1×10-7mol/L ATRA組、1×10-6mol/L ATRA組、1×10-5mol/L ATRA組細胞侵襲數、轉移數［(40±6)、(73±7)個，(26±4)、(61±4)個，(16±3)、(49±5)個)］均減少，與對照組［(63±9)、(89±9)個］比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。②CCK-8法檢測細胞增殖結果顯示，隨著全反式維甲酸藥物濃度的遞增，HeLa/MMC細胞增殖逐漸被抑制;實驗各組與陰性對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。③流式細胞儀檢測結果顯示，全反式維甲酸使進入S期耐藥細胞數減少。1×10-6mol/L ATRA處理3、7 d S期細胞比例分別為(14.90±0.21)%、(6.48±0.18)%;兩個實驗組與對照組(16.28±0.12)%比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。④RT-PCR結果顯示，全反式維甲酸下調癌基因c-myc的轉錄。1×10-6mol/L ATRA處理3、7 d c-myc mRNA相對表達量分別為(0.5406±0.0011)、(0.4312± 0.0009);兩個實驗組與對照組(0.6804±0.0012)比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論全反式維甲酸可抑制宮頸癌耐藥細胞株的侵襲、轉移，其機制可能通過下調癌基因c-myc轉錄實現。

宮頸腫瘤;維甲酸;轉移;侵襲

全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是由維生素A在人體內代謝生成的高活性衍生物，對胚胎發育過程中細胞分化以及機體的生長、發育均具有重要調節作用［1］。到目前為止，ATRA用于急性早幼粒白血病治療的基礎與臨床研究較為深入［2-3］，而有關人體實體瘤的分化研究，已見報道的有結腸癌、胃癌、肺鱗狀上皮癌、乳腺癌等［4-5］。本課題組的前期研究顯示，ATRA能有效抑制宮頸癌細胞HeLa增殖并誘導其分化，且能提高宮頸癌耐藥細胞株HeLa/MMC對化療的敏感性［6］。宮頸癌耐藥細胞株HeLa/MMC較其親本細胞HeLa增殖更快、惡性度更高。本研究以宮頸癌耐絲裂霉素細胞株HeLa/MMC為研究對象，體外觀察ATRA對宮頸癌耐藥細胞侵襲、轉移能力的影響，探討其作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ATRA、二甲基亞礬(DMSO)、PI、CCK-8試劑盒、RNase(Sigma公司、美國)。Transwell小室(Corning公司、美國)。SV總RNA分離試劑盒(Promega公司、美國)。One step RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司、中國)。引物由中國上海Invitrogen公司合成。

1.2 耐藥細胞株HeLa/MMC的建立

耐藥細胞株由武漢大學中南醫院腫瘤研究所惠贈。通過連續性給藥，間歇性增加藥量，逐步提高宮頸癌HeLa細胞培養液中絲裂霉素濃度，獲得對絲裂霉素5.02倍耐藥，對順鉑2倍耐藥的HeLa/MMC細胞株。該細胞株對長春新堿、5-氟尿嘧啶、阿霉素保持敏感。

1.3 方法

1.3.1 耐藥細胞的培養HeLa/MMC細胞培養于含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養液中，培養液中加入絲裂霉素維持其耐藥性，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。視細胞生長情況隔天換液1次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3.2 Transwell小室檢測耐藥細胞的侵襲、轉移能力取對數生長期細胞，細胞計數后調整細胞濃度為1× 106個/mL。細胞轉移試驗中，在Transwell小室的上室中加入100 μL細胞懸液。細胞侵襲實驗，用無血清預冷的DMEM稀釋Matrigel膠(3∶1)。加30 μL稀釋的Matrigel于Transwell小室的上室，37℃放置過夜。上室加入100 μL細胞懸液，設3個復孔。實驗組加入三種濃度ATRA(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)。下室中加入含有10%滅活小牛血清的RPMI1640培養液。陰性對照組加入相應體積培養液。置于5%CO2、37℃、飽和濕度的細胞培養箱中培養36 h。取出小室，用棉簽拭去小室內細胞和Matrigel膠，PBS沖洗，10%甲醛固定15 min，PBS沖洗，0.1%結晶紫染色30 min，清水沖洗后倒置顯微鏡下觀察計數。每個樣本隨機取5個高倍鏡視野(200×)計細胞數，取其平均值。

1.3.3 CCK-8法檢測耐藥細胞的增殖情況將對數生長期細胞接種于96孔培養板，每孔5×103個細胞，實驗組分別加入不同濃度的ATRA(1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5mol/L)，陰性對照組不加藥物，空白對照組無細胞，僅加入相應體積的培養液，各組均設3個復孔。共培養24 h后吸去培養液，每孔加含CCK-8 10 μL的完全培養基100 μL，繼續于37℃5%CO2培養箱中培養3 h，用酶聯儀測450 nm處的OD值。

1.3.4 流式細胞儀檢測耐藥細胞的細胞周期用胰酶將1×10-6mol/L ATRA分別作用3、7 d的實驗組細胞及對照組細胞消化成單細胞懸液，預冷過的70%乙醇固定細胞，4℃冰箱保存。上流式細胞儀檢測前棄乙醇，加入RNA酶作用30 min，100 μg/mL PI染色液4℃避光染色30 min，細胞經300目過濾網后上機檢測。各組測1×104個細胞，經計算機軟件處理得出細胞周期各時相百分比(%)。實驗重復3次。

1.3.5 半定量RT-PCR分析耐藥細胞的c-myc基因表達收集1×10-6mol/LATRA分別作用3、7 d的細胞及對照組細胞，按SV總RNA分離試劑盒說明提取細胞RNA。引物序列設計如下:c-myc上游5’-CTC TCAACGACAGCAGCCCG-3’，下游5’-AGG TGA TCC AGA CTC TGA CC-3’;β-actin上游5’-CGT CTG GAC CTG GCT GGC CGG GAC C-3’，下游5’-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT G-3’。擴增DNA片段大小:c-myc 250 bp，β-actin 600 bp。依據TaKaRa公司的one step RT-PCR試劑盒的操作說明，將反應體系置于DNA循環儀中，42℃逆轉錄60 min，合成互補DNA。95℃預變性5 min，再進行PCR循環。PCR循環條件:95℃變性1 min、56℃退火1 min、72℃延伸1 min。共計30個循環后，72℃延伸7 min。PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測拍照記錄結果。采用HPIAS-2000型圖像分析系統掃描測定，以基因β-actin作為內參照，計算c-myc mRNA的相對表達量并比較表達差異。實驗重復3次。

1.4 統計學方法

用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差(±s)表示。采用one-way ANOVA做多組均數比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞侵襲、轉移能力的變化

Transwell小室檢測細胞侵襲、轉移能力結果顯示:經ATRA處理過的HeLa/MMC細胞侵襲數及轉移數均明顯減少，且隨著藥物濃度增加，細胞侵襲數及轉移數減少。與對照組比較，ATRA各濃度實驗組的侵襲細胞數、轉移細胞數差異有統計學意義(P＜0.05)。說明ATRA能抑制宮頸癌耐藥細胞HeLa/MMC的侵襲和轉移能力。見表1。

表1 全反式維甲酸對HeLa/MMC細胞侵襲、轉移能力的影響(個，±s)

注:與陰性對照組比較，*P＜0.05

組別侵襲細胞數轉移細胞數陰性對照組實驗組1 × 1 0-7m o l / L A T R A 1 × 1 0-6m o l / L A T R A 1 × 1 0-5m o l / L A T R A 6 3 ± 9 8 9 ± 9 4 0 ± 6*2 6 ± 4*1 6 ± 3*7 3 ± 7*6 1 ± 4*4 9 ± 5*

2.2 CCK-8法測定耐藥細胞的增殖情況

實驗組經1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5mol/L ATRA處理后的HeLa/MMC細胞，細胞增殖被抑制。ATRA在1×10-7mol/L的低濃度下就有抑制耐藥細胞株增殖作用，與陰性對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，且隨著濃度遞增，抑制作用逐漸增強。ATRA抑制耐藥細胞增殖的作用存在一定的劑量依賴關系。見表2。

表2 全反式維甲酸對HeLa/MMC細胞的生長抑制作用(±s)

注:與陰性對照組比較，*P＜0.05

組別O D值空白對照組陰性對照組實驗組1 × 1 0-7m o l / L A T R A 5 × 1 0-7m o l / L A T R A 1 × 1 0-6m o l / L A T R A 5 × 1 0-6m o l / L A T R A 1 × 1 0-5m o l / L A T R A 1 0 . 8 5 3 ± 0 . 0 2 4 0 . 5 9 3 ± 0 . 0 3 4*0 . 4 6 6 ± 0 . 0 1 3*0 . 4 2 3 ± 0 . 0 2 2*0 . 3 9 1 ± 0 . 0 1 8*0 . 3 6 7 ± 0 . 0 2 9*

2.3 流式細胞儀檢測耐藥細胞細胞周期的變化

HeLa/MMC細胞經1×10-6mol/L ATRA處理3 d后細胞周期分布的變化，表現在細胞堆積在G1/G0期，而進入S期細胞相應減少。與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。隨著ATRA藥物作用時間的延長，堆積在G1/G0期的細胞比例逐步升高，進入S期的細胞比例相應降低。提示ATRA能阻止HeLa/MMC細胞由G1/G0期進入S期。見表3。

表3HeLa/MMC細胞周期分布(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;ATRA1實驗組:1×10-6mol/L全反式維甲酸處理3 d;ATRA2實驗組:1×10-6mol/L全反式維甲酸處理7 d

組別G1/ G0期S期G2+ M期對照組A T R A1實驗組A T R A2實驗組6 7 . 4 3 ± 0 . 3 8 7 1 . 9 2 ± 0 . 2 1 8 1 . 7 5 ± 0 . 1 3 1 6 . 2 8 ± 0 . 1 2 1 4 . 9 0 ± 0 . 2 1*6 . 4 8 ± 0 . 1 8*1 6 . 2 9 ± 0 . 2 1 1 3 . 1 5 ± 0 . 1 4 1 1 . 7 7 ± 0 . 1 9

2.4 c-myc基因RT-PCR擴增片段的電泳結果

實驗組和對照組(圖1)均可見兩條基因片段: 250 bp的c-myc(目的基因)和600 bp的β-actin(內參基因)。經1×10-6mol/LATRA分別處理3、7 d后的HeLa/MMC細胞c-myc mRNA相對表達量較對照組減少(見圖1c、d)。

2.5 c-myc基因RT-PCR擴增片段的半定量結果

對照組細胞c-myc mRNA相對表達量為(0.6804± 0.0012)。細胞經1×10-6mol/LATRA處理3 d后的c-myc mRNA相對表達量為(0.5406±0.0011)，低于對照組。細胞經1×10-6mol/LATRA作用至7 d時，c-myc mRNA相對表達量降至(0.4312±0.0009)。實驗組與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，這提示ATRA抑制了c-myc癌基因的轉錄。見表4。

表4c-myc基因RT-PCR擴增片段半定量結果(s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;ATRA1實驗組:1×10-6mol/L全反式維甲酸處理3 d;ATRA2實驗組:1×10-6mol/L全反式維甲酸處理7 d

組別c -m y c / β -a c t i n對照組A T R A1實驗組A T R A2實驗組0 . 6 8 0 4 ± 0 . 0 0 1 2 0 . 5 4 0 6 ± 0 . 0 0 1 1*0 . 4 3 1 2 ± 0 . 0 0 0 9*

3 討論

子宮頸癌是發生于宮頸上皮的惡性腫瘤，是女性最常見的生殖道惡性腫瘤。發病率近年來呈上升趨勢，發病年齡趨于年輕化［7］，危害年輕女性的生殖健康?；熆梢钥s小腫瘤病灶，控制轉移灶，在晚期宮頸癌的治療中占有重要地位［8-9］。而且術前的新輔助化療已可替代術前放療，提高手術成功率，同時避免放療引起女性卵巢功能的衰退。化療聯合手術、放療的綜合治療，對于晚期宮頸癌患者改善預后、延長患者生存時間非常重要。然而化療失敗的主要原因是患者化療過程中出現腫瘤耐藥，化療藥無法殺滅腫瘤細胞。而且治療過程中，容易出現腫瘤的播散、遠處轉移，影響患者預后。ATRA作為誘導分化劑，對于調節組織器官的功能和細胞的增殖、代謝、形態分化具有重要作用，以及調控機體生長發育以及維持內環境穩定等方面發揮重要作用［10］。國內有學者發現，ATRA可抑制兔頸動脈粥樣硬化斑塊中血管平滑肌細胞的遷徙轉移，從而抑制兔頸動脈管腔的狹窄。其作用的分子機制是下調c-myc的表達［11］。本研究旨在觀察ATRA對宮頸癌耐藥細胞的侵襲、轉移能力的影響及癌基因c-myc轉錄水平的變化，探討ATRA應對宮頸癌化療耐藥的可行性及其作用的分子靶點。

惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移能力是其區別于正常細胞的生物學特征，也是導致惡性腫瘤患者腫瘤復發、轉移的重要原因。本研究應用Transwell小室檢測細胞侵襲、轉移能力結果顯示，ATRA可抑制宮頸癌耐藥細胞HeLa/MMC的侵襲、轉移能力，隨著藥物濃度的遞增，腫瘤細胞的侵襲、轉移數減少。本研究發現，適當濃度ATRA能抑制HeLa/MMC細胞增殖，降低其惡性度。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，1×10-7～1×10-5mol/L的ATRA對耐藥腫瘤細胞HeLa/MMC細胞的增殖有抑制作用，且這種抑制作用呈劑量依賴性。流式細胞儀檢測結果顯示，ATRA將腫瘤耐藥細胞阻滯于G1期，使進入S期的細胞數明顯減少。這從另一個角度說明ATRA使腫瘤耐藥細胞阻滯于G1期，抑制腫瘤細胞的惡性增殖。

已有研究發現，腫瘤細胞中存在癌基因的異常過表達［8］。不同學者研究證實人宮頸癌及癌旁組織均有c-myc基因擴增，癌組織的擴增倍數高于癌旁組織。c-myc基因的激活和異常表達與宮頸鱗狀上皮癌變過程密切相關［12］。筆者前期研究顯示，耐藥細胞株HeLa/MMC的惡性程度顯著高于宮頸癌細胞HeLa。腫瘤細胞的侵襲、轉移是個多階段、多步驟過程，受多個基因、多個信號分子在時間、空間效應上的共同調節。經典癌基因c-myc位于人8號染色體，其編碼的c-myc核蛋白，參與酪氨酸激酶信號通路，在調控腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移腫瘤耐藥中起重要作用［13-14］。本研究發現ATRA下調耐藥細胞癌基因c-myc的轉錄。隨著ATRA作用時間的延長，HeLa/MMC細胞內癌基因c-mycmRNA的水平逐漸降低。故推測，ATRA可能通過轉錄水平下調HeLa/MMC細胞c-myc的表達，發揮其抑制宮頸癌耐藥細胞侵襲、轉移能力，同時誘導細胞G1期阻滯、抑制細胞增殖。由此，本研究認為c-myc基因是ATRA發揮抗腫瘤效應的關鍵“靶點”基因。

腫瘤化療耐藥是臨床治療惡性腫瘤的難點，也是惡性腫瘤患者預后差的重要原因。鑒于ATRA能抑制宮頸癌耐藥細胞株HeLa/MMC的侵襲、轉移，可以認為ATRA是一種很有前景的治療耐藥宮頸惡性腫瘤的藥物，值得在其調控腫瘤耐藥細胞增殖、侵襲、轉移及作用機制方面的進一步深入研究。

［1］Stavrids MP，Collins BJ，Storey KG.Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embrynonic stem cell differentiation［J］.Development，2010，137(6):881-890.

［2］主鴻鵲，秦亞漆，賴悅云，等.維甲酸和砷劑聯合誘導急性早幼粒細胞白血病中PML-RARα表達上調不影響預后［J］.中國實驗血液學雜志，2013，21(4):872-878.

［3］鄭培烝，周文娟，朱東輝，等.全反式維甲酸誘導NB4細胞分化過程中泛素-蛋白酶體系統的表達變化［J］.福建醫科大學學報，2012，46(5):297-300.

［4］Palomares T，García-Alonso I，San Isidro R，et al.All-transretinoic acid counteract the tumor-stimulating effect of hepatectomy and increases survival of rats bearing liver metastases［J］.J Surg Res，2014，188(1):143-151.

［5］胡海燕，楊尚武，徐瑾.全反式維甲酸對宮頸癌細胞的生物學作用［J］.海南醫學院學報，2008，11(1):12-15.

［6］Shiota G，Kanki K.Retinoids and their target geges in liver functions and diseases［J］.J Gastroenterol Hepatol，2013，28(suppl 1):33-37.

［7］Rydzewska L，Tierney J，Vale CL.Neoadjuvant chenmotherapy plus surgery versus surgery for cervical cancer［J］. Cochrane Database Syst Rev，2010，20(1):CD007406.

［8］Petry KU.HPV and cervical cancer［J］.Scand J Clin Lab Invest Suppl，2014，74(244):59-62.

［9］Robova H，Halaska M，Pluta M.The role of neoadjuvant chemotherapy and surgery in cervical cancer［J］.Int J Gynecol Cancer，2010，20(11):s42-s46.

［10］Gudas LJ.Retinoids induce stem cell differentiation via epigenetic changes［J］.Semin Cell Dev Biol，2014，8(2): 803-808.

［11］郭琳琳，董國雄，張社華，等.全反式維甲酸對兔頸動脈粥樣硬化病變中c-myc表達及血管平滑肌細胞增生的影響［J］.復旦學報:醫學版，2006，33(4):526-529.

［12］Li T，Tang L，Bian T，et al.Detection of hTERC and c-MYC genes in cervical epithelial exfoliated cells for cervical cancer screening［J］.Int J Mol Med，2014，33(5): 1289-1297.

［13］Lun YZ，Cheng J，Chi Q，et al.Transactivation of protooncogene c-Myc by hepatitis B virus transactivator MHBst167［J］.Oncol Lett，2013，24(10-12):701-705.

［14］Riquelme E，Suraokar MB，Rodriguez J，et al.Frequent coamplification and cooperation between C-MYC and PVT1 oncogenes promote malignant pleural mesothelioma［J］.J Thorac Oncol，2014，9(7):998-1007.

Effects of cell migration and invasion of human cervical cancer cell HeLa/ MMC by all-trans retinoic acid and its molecular mechanism

HU HaiyanLIU Zhihua▲The Affiliated Shenzhen Maternity and Child Health Care Hospital of Nanfang Medical University，Guangdong Province，Shenzhen518000，China

Objective To observe the effects of cell migration and invasion on HeLa/MMC cell induced by all-trans retinoic acid(ATRA)and discuss its molecular mechanism.Methods The HeLa/MMC cells were treated with different concentration ATRA(1×10-7，1×10-6，1×10-5mol/L)，migration and invasion ability were detected by transwell chamber assay.The HeLa/MMC cells were treated with different concentration ATRA(1×10-7，5×10-7，1×10-6，5×10-6，1×10-5mol/L)，cell proliferation was detected with CCK-8 kit.The HeLa/MMC cells were treated with 1×10-6mol/L ATRA for 3 days and 7 days，the cell cycles were analyzed by flow cytometry and the changes of c-myc mRNA levels were detected by semiquantitative RT-PCR.Results①The results of transwell chamber assay showed that after treated with 1×10-7mol/L ATRA，1×10-6mol/L ATRA，1×10-5mol/L ATRA，the cell numbers of migration and invasion were decreased［(40±6)，(73±7)；(26±4)，(61±4)；(16±3)，(49±5)］respectively；the three experiment groups were compared with those in control group［(63±9)，(89±9)］，the difference was statistically significant(P＜0.05).②After treated with ATRA，the proliferation on HeLa/MMC cells were inhibited gradually with the elevated concentration of ATRA.These experiment groups were compared with those in control group，the difference was statistically significant(P＜0.05).③ATRA inhibited Hela/MMC from G0/G1to S phrase.After treated with 1×10-6mol/L ATRA for 3，7 days，the ratio of S phrase was(14.90± 0.21)%，(6.48±0.18)%respectively.The two groups were compared with those in control group［(16.28±0.12)%］，the difference was statistically significant(P＜0.05).④ATRA inhibited c-myc transcription.After treated with 1×10-6mol/L ATRA for 3，7 days，the level of c-myc mRNA was(0.5406±0.0011)，(0.4312±0.0009)respectively.The two groups were compared with those in control group(0.6804±0.0012)，the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion ATRA can effectively inhibit the migration and invasion ability of HeLa/MMC cells.One of the mechanism is perhaps the down-regulation of the transcription of c-myc.

Cervicaltumor；Retinoicacid；Migration；Invasion

R737.7

A

1673-7210(2015)02(c)-0018-04

2 0 1 4 -1 0 -1 6本文編輯:張瑜杰)

廣東省深圳市科技計劃項目(編號200702062)。

▲通訊作者