肺癆靈合劑的制備工藝研究

張娜娜 徐文崢 朱建麗

浙江省麗水市中醫院藥劑科，浙江麗水323000

肺癆靈合劑的制備工藝研究

張娜娜 徐文崢 朱建麗▲

浙江省麗水市中醫院藥劑科，浙江麗水323000

目的優選肺癆靈合劑的制備工藝。方法根據處方中藥材性質的不同，以揮發油提取量為指標，采取水蒸氣蒸餾法提取山臘梅;以黃芪甲苷含量為檢測指標，通過L9(34)正交實驗設計及單因素試驗考察，優選其他藥材水提取工藝;然后再用乙醇沉淀法除雜，最后采用熱處理溶解、吐溫-80增溶即得。結果肺癆靈合劑最佳制備工藝為加入5倍處方量水，提取煎煮2次，每次2 h，乙醇醇沉體積分數為60%，熱處理時間為20 min，采用1.5%樣品量吐溫-80進行揮發油增溶。結論優選的肺癆靈合劑制備工藝穩定可行，重復性好，為肺癆靈合劑的開發提供參考。

肺癆靈合劑;黃茂甲苷;正交試驗;澄清度

肺結核，中醫稱為“肺癆”，是當今世界傳染病中的主要殺手，我國結核病年發病人數占全球發病人數比例為14.3%，位居世界第2位［1］，近年來其發病率不斷上升，嚴重危害到人們的身體健康，同時給公共衛生問題帶來新的困難和挑戰［2-3］。目前肺結核已成為我國重點控制的傳染病，多地指定了肺結核定點治療醫院。現階段肺結核的治療主要以化學藥物為主，化學藥物可以使結核病灶纖維化和鈣化，進而達到痊愈的效果。但該抗結核化療過程較長，且需要聯合用藥，藥物蓄積較多，產生各種各樣毒副反應，增加了患者的痛苦［4-6］。同時結核桿菌將機體蛋白用于自身代謝，致使機體負氮平衡，營養代謝紊亂，抵抗力低下。中醫藥治療肺結核注重扶助正氣，提高人體抵抗力，亦能降低化學藥物的毒副作用，提高患者依從性，使患者順利完成全程治療，因此中醫藥防治肺結核越來越受到人們的重視并得到廣泛研究。

肺癆靈合劑為浙江省麗水市中醫院(以下簡稱“我院”)自主研發口服中藥制劑，該方主要由黃芪、黃精、百部、白及、山臘梅等多味中草藥組成，具有滋陰潤肺、健脾補腎、扶正固本之功效。前期臨床試驗中發現:該合劑聯合常規西藥輔助治療初治肺結核，臨床治愈療效和顯效方面得到顯著改善;嚴重胃腸道反應、肝功能損害及白細胞減少等副作用的發生率顯著降低，T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均有不同程度的上升，CD8+、白介素(IL)-1及IL-6水平均有不同程度下降，表明肺癆靈合劑能夠提高機體免疫功能。

前期臨床試驗中，肺癆靈合劑的制備方法為加入4倍處方量的水，浸泡0.5 h，采用全自動煎藥機煎煮1 h。為促進該方更好、更廣泛地用于臨床，本文對其制備工藝進行了研究。根據處方中草藥藥效成分的性質及前期預試驗結果，擬訂該制劑的制備工藝路線為山臘梅采用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，水提醇沉提取其他味中藥材，最后將提取物配液混合，采用L9(34)正交試驗優選肺癆靈合劑提取工藝，為該制劑的進一步研究打下基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司):Alltech2000 ES蒸發光散射檢測器(美國奧泰科技＜中國＞有限公司)，Sartorius BS 124S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 試劑與試藥

黃芪甲苷對照品(批號:110781-200613)由中國藥品生物制品檢定所提供，黃芪、五味子、麥冬、百部等中藥飲片均購于杭州桐君堂醫藥藥材有限公司，經我院制劑室林娜副主任中藥師鑒定為正品，符合《中國藥典》2010年版一部［7］規定。乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水(自制)，其余試劑為分析純，吐溫-80為藥用規格。

2 方法與結果

根據處方中藥材的性質，山臘梅主要含有要含有1，8-桉油素(1，8-cineole)、檜烯(sabinene)、β-蒎烯等揮發油成分［8-9］，其中桉油素含量最大，采用水蒸氣蒸餾法提取。黃芪、黃芩、百合、黃精等其他味藥材主要藥效成分為皂苷、黃酮及其苷、糖、酸、生物堿等，均易溶于水［10-23］，故采用水煎煮法提取。

2.1 山臘梅揮發油提取工藝優選

在前期預試驗基礎上，取處方量的山臘梅碎葉片，加入6倍處方量的水，浸泡6 h，待藥材充分浸透后，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，分別讀取1～7 h揮發油提取量，記錄結果分別為2.05、2.60、3.05、3.45、3.60、3.65、3.65 mL。該提取記錄結果提示:6、7 h揮發油提取量最大，但4 h后揮發油已基本提取完全，為節約時間和能源，選定揮發油提取時間為4 h。分別稱取3份同批次1個處方量的山臘梅碎葉片，按照文中確定的工藝路線提取揮發油，分別記錄揮發油提取量，結果提取量平均為3.38 mL，與優選的工藝提取結果接近，表明優選的提取工藝穩定可行。

2.2 水提取工藝優選

2.2.1 水提取工藝正交試驗設計

以黃芪甲苷含量為檢測指標，選擇L9(34)正交試驗表，對煎煮時間、提取次數、加水量進行考察，因素與水平見表1。

2.2.2 黃芪甲苷的含量測定

2.2.2.1 色譜條件色譜柱:Agilent XDB C18柱(4.6 mm× 150 mm，5 μm);乙腈-水(33∶67)為流動相;柱溫30℃;流速1.0 mL/min;進樣量:10 μL;ELSD參數:漂移管溫度101℃，氣體流速2.7 L/min，氮氣(純度99.9%)壓力25 Pa;按照檢測指標黃芪甲苷計算，理論塔板數不低于4000。

2.2.2.2 黃芪甲苷對照品溶液的制備稱取黃芪甲苷對照品適量，用微量分析天平精密稱定，置于容量瓶中，加甲醇溶解，定容，制備成每1毫升含1 mg黃芪甲苷的溶液，即得，作為對照品溶液［7］。

2.2.2.3 供試品溶液的制備精密量取肺癆靈合劑樣品30 mL，置于250 mL分液漏斗中，分別加入60、40、40、40 mL水飽和正丁醇溶液振搖提取，合并下層正丁醇溶液，然后用40 mL氨試液洗滌2次，丟棄氨試液層，減壓回收正丁醇溶液，得暗黃色殘渣，加入10 mL蒸餾水使殘渣溶解，放冷，將樣品溶液過D101大孔吸附樹脂柱(內徑1.5 cm，長12 cm)，先用重蒸水50 mL洗脫，水層棄去;繼用40%乙醇溶液50 mL洗脫，棄去40%乙醇洗脫液，最后用70%乙醇溶液100 mL洗脫，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮至干，殘渣用少量甲醇溶解并移置5 mL的容量瓶中，然后加甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液［7］。

2.2.3 水提取工藝正交試驗結果

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，按“2.2.2.1”項下色譜條件進行測定，具體結果見表2。

從表2水提取工藝正交試驗結果可以看出，影響黃芪甲苷提取率的各因素主次為A(煎煮時間)＞C(加水量)＞B提取次數，其中煎煮時間的影響最為顯著，其次是加水量，提取次數的影響最小，水提取最佳工藝為A3B2C3，即加入6倍處方量的水，煎煮提取2次，每次2 h。表3正交試驗結果方差分析中數據顯示煎煮時間影響顯著，而加水量及提取次數的影響無顯著性差異，綜合考慮耗時耗能，故確定最佳水提工藝為A3B2C2，即加入5倍處方量水，煎煮提取2次，每次2 h。

2.2.4 水提取工藝試驗驗證

分別稱取3份同批次1個處方量藥材(共940 g)，按照上述選擇的優選工藝(加入5倍處方量水，煎煮提取2次，每次2 h)煎煮中藥材，測定樣品黃芪甲苷含量，黃芪甲苷提取率分別為53.43%、54.04%、53.78%，3次黃芪甲苷提取率平均值為53.75%，表明優選的水提取工藝穩定可重復。

2.3 醇沉工藝優選

中藥材制備提取過程中常常利用醇沉的方法來去除雜質。一般情況下醇沉濃度越高，越有利于去除雜質，但雜質去除的同時也會帶走部分有效成分，導致有效成分含量下降。為了既保證最大限度除去雜質，同時又盡量減少有效活性成分的損失，對不同濃度乙醇的醇沉效果進行了比較研究，分別選擇體積分數為60%、70%、80%、90%的乙醇進行試驗，測定醇沉后黃芪甲苷的含量［20-24］。

分別稱取同批次處方量藥材3份，加入5倍處方量的水，煎煮提取2次，每次2 h，煎煮完成后合并水煎煮液，然后將水提取液減壓濃縮至適量，放冷至室溫后，分別加入體積分數為60%、70%、80%、90%的乙醇進行醇沉，測定醇沉液中黃芪甲苷質量濃度，計算醇沉后黃芪甲苷轉移率。記錄結果顯示，用體積分數60%、70%、80%、90%乙醇沉淀黃芪甲苷轉移率分別為52.10%、50.63%、43.24%、37.85%，數據表明80%以上濃度醇沉黃芪甲苷有損失，60%和70%醇沉差異無顯著性，因此采用60%醇沉工藝。對3份同批次1個處方量的藥材進行醇沉工藝試驗驗證，結果顯示黃芪甲苷平均轉移率為52.23%，與選取結果較近，表明醇沉工藝穩定可行。

2.4 成型工藝

2.4.1 配液工藝優選

分別稱取同批次4個處方量的藥材，加入5倍量水，煎煮提取2次，每次2 h，然后水煎煮液合并減壓濃縮至適量，放冷，加入體積分數為60%乙醇醇沉，制得樣品浸膏，然后將樣品平均分成4份，分別加水至1 L，混勻，加入等量活性炭，煮沸熱處理時間分別為0、10、20、30 min，趁熱濾過，濾液放冷后置冰柜中冷藏3 d，自然沉降，離心分離，灌封，滅菌，得樣品。靜置觀察性狀，結果顯示只有熱處理時間為20、30 min的樣品保持澄清。測定所得樣品中黃芪甲苷質量濃度，記錄結果分別為87.48、87.22、87.00、87.03 μg/mL。該結果表明采用先加熱處理再冷藏的方式可以提高肺癆靈合劑的澄清度，熱處理20 min即可使肺癆靈合劑達到澄清狀態，為節時節能，故選擇熱處理時間為20 min。

2.4.2 揮發油增溶工藝考察

分別量取5份制備好的樣品溶液500 mL，置于1 L燒杯中，各取出樣品溶液100 mL，然后分別加入2.5、5.0、7.5、10、12.5 mL吐溫-80和3.4 mL揮發油攪拌制成乳劑后，加入到剩余400 mL樣品溶液中，置冰柜中冷藏2 d，離心、抽濾、灌封、高壓滅菌，得肺癆靈合劑，觀察其澄清度變化［25-26］。結果顯示，吐溫-80的用量為樣品量的1.5%～2%時溶液澄清度較好，因此為減少增溶劑吐溫-80的用量，節約成本，選擇吐溫-80用量為1.5%。分別稱取3批按照優選揮發油提取工藝、水提醇沉工藝、配液工藝制得樣品溶液，分別加入1.5%樣品量的吐溫-80進行揮發油增溶，結果發現肺癆靈合劑澄清度良好，表明該增溶工藝穩定、可行。

2.5 肺癆靈合劑制備工藝驗證

分別稱取15份同批次處方量的藥材，均按照上文中確定的最佳制備工藝制備肺癆靈合劑樣品，分別讀取揮發油提取量、計算黃芪甲苷轉移率、觀察樣品溶液的澄清度，數據顯示揮發油平均提取量為3.35 mL，黃芪甲苷質量濃度平均為87.01 μg/mL，合劑澄清，均符合質量標準要求且工藝基本穩定。

3 討論

肺癆靈合劑為我院自主研發免疫類中藥協定處方，臨床用于輔助治療肺結核，能明顯提高機體免疫力，減輕常規化學藥物的不良反應，提高患者依從性。但該復方藥材種類繁多，成分復雜，制備方法科學與否直接影響其臨床療效，探索研究該湯劑的制備工藝，是保證肺癆靈合劑質量的重要方法。本文根據處方中藥材性質的不同，通過正交實驗設計，探討了先利用水蒸氣蒸餾法提取山臘梅揮發油，然后用水煎煮法提取其他藥味水溶性成分，最后再將揮發油與水提液浸膏樣品混合的制備方法。最終得到的肺癆靈合劑最佳制備工藝方案是:山臘梅碎葉片中揮發油提取方法為水蒸氣蒸餾法，提取時間為4 h;其他味藥材藥材加入5倍處方量水，提取2次，每次煎煮2 h;用體積分數為60%乙醇醇沉;加入1.5%樣品量吐溫-80促進揮發油增溶。經工藝驗證，該制備工藝穩定可行，重復性好，能有效控制肺癆靈合劑的質量。

研究肺癆靈合劑制備工藝過程中還考察了黃芪甲苷供試品溶液的制備方法中過柱、水飽和正丁醇溶液的萃取體積、萃取次數及氨試液洗滌次數對黃芪甲苷轉移率的影響，結果表明:不過柱時黃芪甲苷與相鄰峰分離度達不到要求;水飽和正丁醇溶液提取4次，每次分別為60、40、40、40 mL時，提取效果最好;氨試液洗滌2次和3次，黃芪甲苷提取率無明顯差異。實驗曾參考有關文獻，選用乙腈-水(33∶67)為流動相、乙腈-水-四氫呋喃(33∶67∶4)為流動相，流速: 0.8 mL/min，以Aichrom Reliasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱為分析柱，柱溫為25℃，ELSD參數:漂移管溫度70℃，氮氣壓力45 Pa，進行試驗研究，結果兩者達到滿意的分離效果，黃芪甲苷峰已達基線分離，峰形對稱;缺黃芪陰性對照樣品均無干擾。本實驗選用乙腈-水(33∶67)為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫為30℃;用Alltech2000 ES蒸發光散射檢測器檢測:漂移管溫度101℃，氣體流速2.7 L/min。

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Study on processing technology of Feilaoling Preparation

ZHANG Na'naXU WenzhengZHU Jianli▲Department of Pharmacy，Lishui Chinese Medicine Hospital，Zhejiang Province，Lishui323000，China

Objective To optimize the processing technology of Feilaoling Preparation.Methods According to the properties of traditional Chinese herbal medicine in prescription，with the extraction amount of volatile oil as index，the extraction of Chimonanthus nitens was by steam distillation method.And with the content of astragalosideⅣas evaluation index，optimum water extraction technology of other herbal medicine was optimized by orthogonal design of L9(34) test and single factor test.Then impurity was removed by ethanol precipitation.Finally，Feilaoling Preparation was obtained by heating the solution of sample extract and promoting dissolution of volatile oil with Tween-80.Results Optimum technology of producing feilaoling mixture was extracted 2 times with 5 times the amount of water for 2 h each time，the concentration of ethanol precipitation was 60%，the boiling time was 20 min，1.5%Tween-80 was used for solubilizing volatile oil.Conclusion The optimized processing technology of Feilaoling Preparation is stable，feasible and reproducible，it can provide a reference for development of Feilaoling Preparation.

Feilaoling Preparation；AstragalosideⅣ；Orthogonal design；Clarity

R283.1

A

1673-7210(2015)02(c)-0078-04

2014-11-25本文編輯:衛柯)

浙江省醫學會臨床科研基金項目(編號2012ZYC-B4);浙江省麗水市科技局市級公益性技術應用項目(編號2013JYZB25)。

張娜娜(1987.10-)，女，山東滕州人，碩士;研究方向:醫院藥學與藥物制劑研究。

▲通訊作者