急性一氧化碳中毒對大鼠少突膠質前體細胞的影響

孫瑞佼，郭大志，李航，李銘鑫，胡慧軍，潘曉雯

急性一氧化碳中毒(acute arbon monoxide poisoning，ACOP)是國內外最常見的意外中毒之一[1]，研究證實，腦白質的脫髓鞘改變是最常見、最主要的病理改變[2]，但髓鞘脫失機制不詳。在中樞神經系統中，少突膠質前體細胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)向少突膠質細胞(oligodendrocytes，OLs)的分化是髓鞘形成的關鍵步驟，也是髓鞘損傷后再生修復的主要來源[3]。本研究應用免疫組織化學染色和Western Blot觀察ACOP大鼠中樞神經系統髓鞘損傷后髓鞘標志物髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)和OPCs特異性細胞標志物硫酸軟骨素蛋白多糖NG2表達的變化，為探討ACOP后中樞神經系統髓鞘脫失機制提供一定的實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物：健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠36只(軍事醫學科學院實驗動物中心提供)，清潔級，9～10周齡，體質量200～250g，于12h明-暗交替、室溫18～20℃的動物房適應性飼養1周。自由進食標準大鼠飼料及普通自來水。②主要儀器和設備：輪轉切片機(德國Leica公司)，組織勻漿器(BIOSPEC公司)，低溫水平離心機(美國)，垂直電泳槽(BIO-RAD公司)，半干轉移電泳儀(BIO-RAD公司)，凝膠成像分析系統(美國)，全自動顯微照相機(日本Olympus)。

1.2 方法 參照Fechter[4]及王耀宏等[5]的研究，利用分次腹腔注射CO法制作ACOP大鼠模型。參考前期預實驗結果，預計染毒死亡率約50%，故36只SD大鼠中按電腦隨機數選取24只進行染毒，分次腹腔內注射純品CO氣體(99.9%，燕山石化)，首次劑量120ml/kg，后以半量追加注射3次，每次間隔4h。其余12只作為對照組按同樣方案注射空氣。染毒后每隔15～20min觀察1次大鼠變化。造模結束后從存活大鼠中隨機選取12只作為染毒組納入實驗；正常對照組注射空氣后無死亡，全部納入。

1.3 檢測指標 ①免疫組織化學染色：在染毒后第1d、3d，2組各隨機取3只大鼠，腹腔注射20%烏拉坦(0.7 ml/100g體質量)麻醉，灌注，取腦，4%中性甲醛液固定2h，30%蔗糖溶液脫水7d，浸蠟，包埋，切片(厚度15um)，石蠟切片脫蠟后，3%雙氧水滅活內源性過氧化酶，經微波對抗原進行熱修復后加入一抗MBP、NG2，0.01mol/L PBS清洗后，添加生物素標記的山羊抗兔二抗，37℃孵箱孵育30min，PBS清洗后加入ABC復合物，37℃孵箱孵育30min。DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水，透明，封片。②組織蛋白樣本制備及Western Blot分析：在相同實驗節點2組各隨機取3只大鼠，處死后取腦，加入5ml細胞裂解液及蛋白酶抑制劑充分勻漿，再加蛋白上樣液，95℃加熱5min，離心后取上清，每孔加樣5ul，用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，經轉膜及封閉后，將膜移入含抗MBP、NG2多克隆抗體的一抗反應液中，4℃過夜，洗膜后加入二抗，室溫避光緩搖60min，洗膜后掃描，攝片。③圖像分析： MBP、NG2免疫組織化學染色結果：在光鏡下采集圖像，每個標本取5個視野，應用Imagic-Pro 5.1圖像分析軟件測定髓鞘、MBP、NG2的積分光密度值(integral optical density，IOD)。Western Blot以β-actin為內參，計算目的蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 染毒后表現 大鼠腹腔注射CO后中毒癥狀與王耀宏等[5]文獻報道類似，5～10min出現煩躁、撞籠，15min陸續出現少動、四肢癱軟、抽搐、昏迷，黏膜及肢端皮膚呈櫻桃紅色，部分發生角弓反張。上述癥狀體征持續至末次染毒后6h逐漸消失。造模后CO染毒組存活14只，死亡10只，尸檢發現大鼠皮膚黏膜及肝臟呈典型“櫻桃紅”樣改變，心臟、肝臟及脾臟等臟器重度充血伴散在出血點，腦組織充血水腫嚴重。對照組大鼠無異常表現，無死亡。

2.2 免疫組織化學染色結果 大鼠ACOP后1d，MBP表達輕度下降，與對照組比較IOD值差異無統計學意義；3d后MBP表達進一步下降，與對照組比較IOD值差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1；大鼠ACOP后1d，NG2表達減少，與對照組比較IOD值差異無統計學意義，3d時進一步減少，與對照組比較IOD值顯著下降(P<0.05)，見圖2。局部放大后觀察，對照組可見數目較多的NG2陽性細胞，胞體小，呈圓形或橢圓形，從胞體向四周放射狀伸出多數突起。染毒3d后OPCs數量減少，細胞形態異常，胞體縮小，突起減少，見圖3。具體數據見表1。

2.3 Wester Blot檢測結果 2組大鼠腦組織中均有MBP、NG2表達，相對分子質量MBP為18500、NG2為300000。MBP、NG2在對照組中正常表達，染毒組染毒1d后MBP及NG2表達均減少，3d時進一步減少，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4，5。

a.染毒組1d b.染毒組3d

c.對照組1d d.對照組3d

圖1a～d 大鼠腦組織MBP免疫組織化學染色結果(×40)

a.染毒組1d b.染毒組3d

c.對照組1d d.對照組3d

圖2a～d 大鼠腦組織NG2免疫組織化學染色結果(×40)

a.染毒后3d b.正常對照

圖3a～b 3d大鼠腦組織NG2免疫組織化學染色局部放大(×60)

組別nMBP1d3dNG21d3d對照組317.74±0.8318.24±1.0314.95±0.7514.56±0.83染毒組316.24±0.8915.15±0.75a13.22±0.6610.85±0.93a

與對照組比較，aP<0.05

對照組 中毒1d 中毒3d

圖4 大鼠腦組織MBP表達的Western Blot電泳圖

對照組 中毒1d 中毒3d

圖5 大鼠腦組織NG2表達的Western Blot電泳圖

3 討論

建立合適的動物染毒模型是進行相關中毒研究的基礎，目前常用ACOP模型的造模方法有吸入染毒法和腹腔注射染毒法。溫韜等[6]在Fechter基礎上改良的分次腹腔注射染毒法，具有操作簡單、染毒程度容易控制等優點，注射后血碳氧血紅蛋白可迅速升高至所需水平，并引起明顯中毒癥狀，神經系統損傷及生化指標改變均與臨床所及CO中毒表現一致。因此本研究選用此方法進行造模。但此方法在染毒過程中有一定的死亡率，死亡率隨注射劑量增加而增大，且死亡大都發生于首次注射后。王耀宏等[5]研究發現，對體質量240～280g的大鼠，腹腔注射CO半數致死劑量為146ml/kg，95%可信范圍129～165ml/kg。在保證大鼠出現明顯中毒效應，且死亡率可接受的前提下，我們選用首次注射劑量為120ml/kg。王耀宏等[5]報道此劑量大鼠死亡率約30%，而我們在前期預實驗中發現死亡率約50%，此差異推測與本研究所選用大鼠體質量較小(200～250g)，耐受性相對較差有關。實驗中對24只大鼠進行染毒，死亡10只，實際死亡率41.67%。

ACOP后腦白質脫髓鞘的機制尚不明確，在其它腦白質脫髓鞘疾病，如缺血缺氧性腦病、多發性硬化癥的研究中發現，缺血缺氧后星形細胞、小膠質細胞、巨噬細胞和中性白細胞被激活后釋放大量的炎性細胞因子、蛋白酶、NO 和氧自由基，這些物質均可直接或間接地造成OLs損傷，最終導致腦白質缺血性脫髓鞘病理改變[7-10]；多發性硬化癥盡管機制不明，但其主要病理進程基本取得共識[11]，包括原發性脫髓鞘，此時很少有OLs的損傷；脫髓鞘過程中OLs的廣泛丟失；原發性OLs損傷并導致繼發性脫髓鞘；大量的巨噬細胞被激活，引起非選擇性的組織損傷，不僅累及髓鞘還涉及軸突和星形膠質細胞。ACOP對人體的損傷機制非常復雜，既往研究已證明存在與上述腦缺血缺氧、多發性硬化等疾病類似的缺氧損害、免疫損傷、氧化應激、炎癥損傷等損傷機制[12-13]。除此以外，CO還特有細胞毒性作用，能直接作用于線粒體造成細胞損傷[14]。ACOP后中樞神經系統脫髓鞘是否與OLs受損有關，目前尚無研究報道。從本實驗結果看，中毒后1d即可看到MBP表達較正常對照組減少，3d時進一步減少，證明ACOP后大鼠中樞神經系統發生脫髓鞘改變。

在中樞神經系統中，OPCs向OLs的分化是髓鞘形成的關鍵步驟，也是髓鞘損傷后再生修復的主要來源[15]。大量研究表明在各種損傷因素導致脫髓鞘病變后，OPCs開始增殖并遷移至脫髓鞘區域，分化為OLs包裹脫髓鞘軸突形成新的髓鞘。另外有研究發現在缺血損傷區域存活下來的OLs不能進行分化和髓鞘再生，有高度遷移和分化潛能的OPCs形成的新生少突膠質細胞是髓鞘再生的來源[16]。作為髓鞘脫失后修復的主要來源，OPCs受損會對髓鞘修復造成影響，導致修復不良或不能修復。近年來研究發現，OPCs對缺血缺氧等刺激同樣敏感，腦缺血引起的能量耗竭、氧化應激同樣會損傷OPCs[17-18]。另外，OPCs膜上分布有豐富的非N-甲基-D-天冬氨酸(non-N-methyl-D-aspartic acid，non-NMDA)受體，腦缺血后細胞間隙積聚的大量興奮性氨基酸將激活non-NMDA受體，損傷OPCs[19]。在慢性多發性硬化患者中，OPCs很少分化，這與患者后期髓鞘修復失敗相吻合[20]。從本實驗結果來看，ACOP后1d 即可看到NG2表達減少，3d時進一步減少；與正常對照組比較，中毒后3d時OPCs數量明顯減少，殘存細胞形態異常，胞體縮小，突起減少，表明ACOP對OPCs造成損傷。此外有研究顯示，老年大鼠腦內的OPCs移動能力較弱，細胞形態與成年大鼠不同[21]，而臨床上觀察到在ACOP患者中高齡患者髓鞘脫失持續時間長，恢復慢，遲發腦病的發生率明顯高于年輕患者[22]。

綜上，ACOP在造成中樞神經系統脫髓鞘的同時，也對OPCs細胞造成損傷。推測OPCs受損后不能及時分化成OLs修復脫失的髓鞘，是后續發生遲發腦病的可能機制之一，有待進一步研究證實。

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