電針對腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

鄭彩霞，韓肖華，黃曉琳，郭雅碧

國際阿爾茨海默氏病聯(lián)盟(Alzheimer's Disease International,ADI)統(tǒng)計(jì)表明：截止2013年，全世界范圍內(nèi)癡呆患者達(dá)到4 440萬，預(yù)計(jì)到2050年，癡呆患者將超過13 550萬。血管性癡呆(vascular dementia,VaD)占癡呆總數(shù)的20%～30%，是僅次于阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)的第2大癡呆類型[1]。針灸作為替代療法對VaD的改善作用在中西方已經(jīng)得到越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[2-3]，但其具體機(jī)制尚不明確。韓肖華等[4]發(fā)現(xiàn)電針(electroacupuncture,EA)刺激百會穴和大椎穴7d可促進(jìn)腦缺血大鼠海馬蛋白激酶A-環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(protein kinase A-cAMP response element binding protein,PKA-CREB)信號通路激活，使磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein,pCREB)和Bcl-2蛋白量升高，Bax蛋白量下降，Morris水迷宮成績提高。在以上研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置術(shù)后7d、14d、21d 3個時間點(diǎn)，通過延長觀察時間，進(jìn)一步探討電針對腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響及可能內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動物：SPF(Specefic pathogen Free)級成年SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠90只，體質(zhì)量250±20g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供(許可證號：SCXK(湘)2011-0003)。②主要試劑：PKA選擇性抑制劑H89(Sigma公司)、TUNEL試劑盒(Roche公司)、兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)、兔抗大鼠Bax單克隆抗體(Abcam公司)、兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體(Abcam公司)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(KPL公司)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)公司)。③主要材料與儀器：PVDF膜(Millipore公司)，電針儀(上海G6805-II型)、毫針(華佗牌，30號)、腦立體定位儀、微量注射器、尼康E100型生物顯微鏡、佳能600D相機(jī)。

1.2 方法 ①分組及處理：90只大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、電針組、電針+H89組和電針+NS組各18只，每組又分成7d、14d、21d 3個亞組(n=6)，每組其中3只新鮮取材后用于Western blotting檢測，另外3只灌注后用于原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)檢測。②側(cè)腦室注射：電針+H89組和電針+NS組大鼠分別側(cè)腦室注射H89(2μg/μL)或NS 10 μL后再制作腦缺血模型。側(cè)腦室定位坐標(biāo)：前囟后0.8mm，前囟右側(cè)1.5mm，硬腦膜下約4.0mm。第14d、21d組大鼠每間隔1周重復(fù)側(cè)腦室注射H89或NS一次。③造模：制備雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(2-vessel occlusion,2VO)模型：鈍性分離頸總動脈后分別結(jié)扎近端和遠(yuǎn)端并剪斷中部；假手術(shù)組大鼠僅分離雙側(cè)頸總動脈但不接扎和剪斷。④電針治療：電針組、電針+H89組和電針+NS組大鼠于造模次日開始接受電針治療。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]，“百會”穴位于頂骨正中，“大椎”穴位于背部正中第7頸椎與第1胸椎間。用針灸毫針斜刺入“百會”1cm， 直刺入“大椎”0.5cm后連接上海G6805-II型電針儀，“百會”接負(fù)極，“大椎”接正極，選取連續(xù)波，頻率20Hz，強(qiáng)度以觀察到大鼠眼瞼輕微顫動為宜，每天1次，每次20min，根據(jù)分組分別連續(xù)治療7d、14d或21d。假手術(shù)組及模型組大鼠術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，無其他特殊處理。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn) ①組織切片：10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后，經(jīng)心臟依次快速灌注生理鹽水250ml及4%多聚甲醛250ml，斷頭取腦后置于4%多聚甲醛中后固定24h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟及包埋。按照《大鼠腦立體定位圖譜》在海馬典型位置連續(xù)冠狀切片(厚度4μm)[6]，每間隔12μm留取1張切片，每個腦組織取3張切片用于TUNEL檢測。②TUNEL檢測：實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書操作。在400倍光學(xué)顯微鏡下，每張切片分別拍攝雙側(cè)海馬CA1區(qū)，每側(cè)CA1區(qū)隨機(jī)選取2個視野拍照。采用Image-Pro Plus軟件計(jì)數(shù)各視野下凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算凋亡細(xì)胞所占比率，以上述4個視野下凋亡細(xì)胞率的均值作為該大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞率的值。③蛋白免疫印跡(Western blotting)：10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后，直接斷頭取腦并迅速分離出海馬組織。取1/2海馬組織塊與裂解液混合并勻漿，離心(4℃，14000g，20min)后，提取總蛋白液。上樣量60μg，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)(濃縮80V 30min；分離120V 90min)和轉(zhuǎn)膜(200mA 70min)，再先后孵育一抗(1∶2000，4℃，12h)和二抗(1∶10000，室溫，2h)；經(jīng)X膠片曝光顯像，采用Image-J軟件分析目標(biāo)蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值并計(jì)算比值。

2 結(jié)果

各組大鼠組內(nèi)3個時間點(diǎn)間的海馬神經(jīng)元凋亡率相比，模型組14d組、21d組較7d組顯著增加(P<0.05)；其余各組各時間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較，電針組21d組較14d組Bcl-2蛋白量顯著增多(P<0.05)。其余各組各個評價指標(biāo)在3個時間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時間點(diǎn)各組大鼠間海馬神經(jīng)元凋亡率比較，模型組較假手術(shù)組均顯著增加(P<0.05)；電針組較模型組均顯著降低(P<0.05)；電針+H89組較電針+NS組均顯著增多(P<0.05)。同時間點(diǎn)各組大鼠間的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較，模型組較假手術(shù)組Bax蛋白量均顯著增高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白量均顯著降低(P<0.05)；電針組較模型組Bax蛋白量均顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2蛋白量均顯著增加(P<0.05)；電針+H89組較電針+NS組Bax蛋白量均明顯增多(P<0.05)，而Bcl-2蛋白量明顯降低(P<0.05)，但在14d時2組Bcl-2蛋白表達(dá)差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1及表1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)Bax蛋白、Bcl-2蛋白的表達(dá)

a.假手術(shù)組；b.模型組；c.電針組；d.電針+H89組；e.電針+NS組

表1 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率、Bax蛋白相對表達(dá)量、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較

與同組7d比較，aP<0.05；與同組14d比較，bP<0.05；與同時間點(diǎn)假手術(shù)組比較，cP<0.05；與同時間點(diǎn)模型組比較，dP<0.05；與同時間點(diǎn)電針+NS組比較，eP<0.05

3 討論

慢性腦低灌注是VaD和AD患者發(fā)生認(rèn)知功能下降的基本發(fā)病機(jī)制之一[7]，大鼠2VO模型常用于模擬人類大腦慢性低灌注病變。在該模型中，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失隨缺血時間延長逐漸加重，在術(shù)后2周[8]、4周[8]和8～13周[9]，分別有6%～29%、55%和67%的大鼠出現(xiàn)海馬結(jié)構(gòu)破壞，這與本實(shí)驗(yàn)中模型組7d、14d、21d神經(jīng)元凋亡率逐漸加重的結(jié)果相一致。腦缺血后機(jī)體PKA-CREB信號通路可被激活[2]，可通過調(diào)控多種靶基因的轉(zhuǎn)錄而力圖減輕腦缺血缺氧引起的神經(jīng)功能失穩(wěn)和認(rèn)知功能下降，其中Bcl-2[10]、BDNF等基因與神經(jīng)元存活密切相關(guān)[10-11]。Bcl-2蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抗凋亡蛋白，而Bax蛋白會促進(jìn)凋亡[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，3個時間點(diǎn)模型組與假手術(shù)組相比，Bax蛋白量顯著升高，伴有Bcl-2蛋白量顯著降低，可能是模型組海馬CA1區(qū)海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高的內(nèi)在機(jī)制之一。

電針具有抗腦缺血后細(xì)胞凋亡的作用。陶靜等[13]研究表明電針可抑制局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Bax蛋白表達(dá)，提高Bcl-2、BDNF蛋白表達(dá)，加速神經(jīng)功能恢復(fù)。余茜等[14]研究表明電針可上調(diào)右側(cè)大腦中動脈缺血模型大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)而促進(jìn)腦梗死大鼠行為能力恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，電針組較模型組神經(jīng)元凋亡率和Bax蛋白量均顯著下降，同時Bcl-2蛋白量均顯著升高，提示電針可以明顯改善腦缺血后神經(jīng)元凋亡反應(yīng)。但同時，分別電針治療7d、14d、21d 的三組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率仍然呈增加的趨勢，分析可能原因：持續(xù)性腦流量下降發(fā)生15～20min后神經(jīng)元開始發(fā)生不可逆性損傷[15]，并且隨缺血缺氧時間延長神經(jīng)元病變范圍和程度會進(jìn)行性加重，盡管電針組較同時間點(diǎn)模型組凋亡進(jìn)展的嚴(yán)重程度已經(jīng)顯著緩解，但并不能逆轉(zhuǎn)或者完全遏制凋亡反應(yīng)逐漸加重的趨勢。同時我們還發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白量在電針組21d組較14d組顯著增加，提示增加電針療程可能對神經(jīng)元的保護(hù)作用更明顯。

H89是蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的選擇性抑制劑，在電針治療前側(cè)腦室注射H89組與NS組的大鼠相比，神經(jīng)元凋亡率和Bax蛋白表達(dá)均顯著增加，伴有Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降，說明電針的抗神經(jīng)元凋亡作用被抑制，反向驗(yàn)證了電針的內(nèi)在機(jī)制之一可能與激活PKA-CREB通路相關(guān)。電針+H89組與電針+NS組在14d時Bcl-2蛋白量無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能有以下原因：①多種激酶[如Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶IV(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type IV,CaMK IV)]都能磷酸化CREB[16]，當(dāng)CaMK IV激活CREB后也可以調(diào)控Bcl-2基因的表達(dá)，此時H89不能阻斷其他激酶對CREB及Bcl-2基因的作用；②后續(xù)如果增加14d、21d組的樣本量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能更有說服性。

綜上所述，電針刺激百會穴和大椎穴7d、14d和21d均可以明顯減輕腦缺血后海馬神經(jīng)元凋亡，其內(nèi)在機(jī)制可能與激活PKA-CREB信號通路后調(diào)節(jié)Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果提示PKA-CREB信號通路可能是電針的作用機(jī)制之一，但電針是否影響該信號通路上其他基因的調(diào)控有待進(jìn)一步研究。

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